賴紅偉，曹宏梅，王宇卓，杜鵑，蔣金鑫，姜濤，陶然，董順福

（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

化學(xué)振蕩是目前非線性化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究的重要內(nèi)容，且一直是物理化學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。它與普通的化學(xué)反應(yīng)不同，各組分濃度隨時(shí)間不是單調(diào)地變化，而是會(huì)隨時(shí)間或空間位置發(fā)生周期性的變化[1]。這種規(guī)律性的變化與一些生物振蕩現(xiàn)象（如心臟跳動(dòng)、鈣振蕩和糖酵解等）極其類似，因而使人們逐漸認(rèn)識(shí)到生命現(xiàn)象和非生命現(xiàn)象之間遵循著某種相似的規(guī)律[2-3]。在均相的化學(xué)振蕩反應(yīng)中，由于B-Z振蕩具有簡單、穩(wěn)定的特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、食品和藥物分析等許多領(lǐng)域，并取得了一些重要進(jìn)展[4]。B-Z振蕩的反應(yīng)現(xiàn)象雖簡單，但反應(yīng)機(jī)理卻較為復(fù)雜，其中可能涉及到的基元反應(yīng)多達(dá)二十個(gè)，目前普遍為人們所接受的是著名的FKN機(jī)理[5]。當(dāng)振蕩反應(yīng)進(jìn)行到某個(gè)階段時(shí)，向體系中加入某種待測物，若該物質(zhì)與該階段的某個(gè)反應(yīng)物或產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，則必然會(huì)影響振蕩參數(shù)（如振蕩周期、振幅和誘導(dǎo)期等）的變化。隨被測物加入量的增大，所引起的變化值也隨之增大，據(jù)此就可對(duì)一些物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析[4]。

茶多酚（tea polyphonels，簡稱TP）是一種從天然植物茶葉中提取的多羥基酚類衍生物的混合物，其中含量最高的是表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG），約占60%～80%。研究表明，這種多酚類物質(zhì)具有優(yōu)異的抗氧化性能和顯著清除自由基的能力[6]。茶多酚產(chǎn)品的應(yīng)用已有近20年的歷史，其中高純度的茶多酚主要用于醫(yī)藥行業(yè)，而一般純度的茶多酚則用于食品、保健品和化工等領(lǐng)域[7-8]。所以，有關(guān)茶多酚的分析測試就顯得十分重要。

茶多酚是由30多種含酚羥基的物質(zhì)組成的一類混合物，因此茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品的組成很難確定。目前國際上均采用沒食子酸（GA）作為標(biāo)準(zhǔn)品來定量茶多酚的含量，為此本研究也采用了沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品來測定綠茶中的茶多酚含量。本文中研究了茶多酚對(duì)經(jīng)典的B-Z振蕩體系的影響行為，建立了一種低成本、耗時(shí)短、易操作和高靈敏度的測定茶多酚含量的新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（AR）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；綠茶：吉林市多客源超市；丙二酸、溴酸鉀、濃硫酸、硫酸鈰銨：分析純；水為二次蒸餾水。

索式提取器；新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；申科R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申順生物科技有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；W201D型恒溫水浴鍋：上海申順生物科技有限公司；FA1104N型電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；ZH-1C型超級(jí)恒溫水?。耗暇┒嘀萍及l(fā)展有限公司；KH5200DB型數(shù)控超聲波清洗器：麗山水利超聲有限公司；BZ振蕩實(shí)驗(yàn)裝置：南京多助科技發(fā)展有限公司；HJ-1型磁力攪拌器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；232型飽和甘汞電極：上海越磁電子科技有限公司；213型鉑片電極：天津市蘭立科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司；玻碳電極：上海辰華儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 B-Z振蕩體系的建立

在100 mL恒溫夾套玻璃反應(yīng)容器中，以鉑電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極。首先加入一定濃度的丙二酸、H2SO4和KBrO3水溶液各15.00 mL，攪拌均勻，同時(shí)設(shè)定溫度為37℃，至少恒溫10 min。然后再加入已恒溫的一定濃度的硫酸鈰銨水溶液15.00mL，混合液總體積固定為60.00 mL，與此同時(shí)用B-Z振蕩試驗(yàn)裝置記錄電位（E）-時(shí)間（t）曲線。

1.2.2 綠茶中茶多酚的提取

將茶葉烘干，粉碎后，過40目篩，裝瓶待用。稱取5.0 g并用濾紙包包好置于索氏提取器中。首先用50%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇濃度140 mL，提取2 h；然后將粗提液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至20 mL，在1 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心去掉殘?jiān)蝗缓笥玫润w積石油醚萃取3次。上述萃取液再繼續(xù)加入一定體積的超純水旋蒸數(shù)次，直至除掉乙醇及乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，最后定容至100 mL容量瓶中，即得茶多酚提取液。

1.2.3 沒食子酸（或茶多酚）對(duì)B-Z振蕩體系的振動(dòng)

待B-Z振蕩體系達(dá)穩(wěn)定后，分別在誘導(dǎo)期處，第7個(gè)波峰和波谷處加入一定濃度的沒食子酸水溶液，觀察電位（E）-時(shí)間（t）的變化，從而建立測定茶多酚的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

基于沒食子酸對(duì)B-Z振蕩體系的擾動(dòng)規(guī)律，在指定位置處加入一定濃度的綠茶提取液，同時(shí)記錄其E-t曲線，根據(jù)振蕩周期的改變量來確定綠茶提取液中茶多酚的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件對(duì)振蕩圖譜的影響

試驗(yàn)表明，振蕩體系中各組分的濃度變化是影響分析測定時(shí)的靈敏度和精密度的主要因素。為了獲得規(guī)則穩(wěn)定的振蕩曲線，在之前的研究工作中，確定了B-Z振蕩反應(yīng)中各組分的最佳濃度：丙二酸、硫酸、溴酸鉀和硫酸鈰銨濃度分別為0.45、3、0.25 mol/L和4×10-3mol/L[9]。反應(yīng)溫度對(duì)振蕩反應(yīng)的誘導(dǎo)期和振蕩周期影響較大，而對(duì)振幅的影響較小。當(dāng)溫度較高時(shí)，振蕩反應(yīng)速率加快，所以誘導(dǎo)期時(shí)間大大縮短，振蕩周期也明顯減小。而當(dāng)溫度較低時(shí)，誘導(dǎo)期時(shí)間過長，振蕩波形不穩(wěn)定性，同時(shí)也不利于快速測定。本文中反應(yīng)溫度為37℃，此溫度為人體的正常溫度[9]。此外，攪拌對(duì)振蕩參數(shù)也有一定的影響。當(dāng)提高攪拌速率時(shí)，反應(yīng)物和產(chǎn)物的擴(kuò)散迅速，振蕩周期和振幅也發(fā)生一定幅度的改變。另外，攪拌也影響氧及二氧化碳在振蕩體系中的溶解度，溶解氧作為一種反應(yīng)物可能也參與有關(guān)振蕩反應(yīng)[10]。本研究中攪拌速率為500 r/min，可以保證振蕩波形的穩(wěn)定。

2.2 沒食子酸對(duì)B-Z振蕩體系的影響

沒食子酸對(duì)B-Z振蕩體系的影響見圖1。

圖1 沒食子酸對(duì)B-Z振蕩體系的影響Fig.1 The influence of gallic acid on the B-Z oscillating system

本研究中參照紫外-可見分光度法測定茶多酚的方法，我們選用沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。從圖1中可以看出，在B-Z反應(yīng)的不同階段加入等量的沒食子酸水溶液，振蕩體系的誘導(dǎo)時(shí)間、振蕩周期和振幅都發(fā)生了改變。對(duì)于誘導(dǎo)時(shí)間，在誘導(dǎo)期處加入沒食子酸時(shí)的誘導(dǎo)時(shí)間持續(xù)較長（162 s），而在波峰和波谷處時(shí)則稍短（157 s）。除此之外，隨振蕩反應(yīng)的進(jìn)行，誘導(dǎo)期處的最低振蕩電位低于0.95 V，而波峰和波谷處則稍高于0.95 V。以上事實(shí)表明沒食子酸可能與丙二酸一起作為有機(jī)底物參與了振蕩反應(yīng)，宏觀上表現(xiàn)為振蕩波形與波峰和波谷處時(shí)不同，這與文獻(xiàn)中的報(bào)道是相符的[12]。比較波峰和波谷處加入沒食子酸的振蕩波形，二者振蕩電位變化幾乎相同。

另外，對(duì)比波峰和波谷處加入沒食子酸的振蕩波形，可以發(fā)現(xiàn)在波谷處時(shí)的波形比較穩(wěn)定，適于測定茶多酚，為此選擇在波谷處加入沒食子酸來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。可知，在第7個(gè)波谷處加入沒食子酸，當(dāng)其濃度在1.6×10-2g/L～4.5×10-2g/L范圍內(nèi)時(shí)，其濃度與振蕩周期的改變量（ΔT）之間存在著良好的線性關(guān)系，即ΔT/s=328.3×[原花青素濃度]+3.1（R=0.999 0，n=9）。

圖2 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of gallic acid

為保證分析測定茶多酚具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，在保持各條件不變的情況下，連續(xù)重復(fù)了6組試驗(yàn)，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.4%，該數(shù)值＜5%，這表明試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性良好（見表1）。沒食子酸的檢測限為1.37×10-9g/L。

表1 化學(xué)振蕩法測定沒食子酸含量Table 1 The measurement of gallic acid by chemical oscillation method

2.4 茶多酚的測定

為研究本試驗(yàn)所提出的方法的準(zhǔn)確度，將提取的茶多酚溶液分別用紫外-可見分光光度法和化學(xué)振蕩法進(jìn)行了測定，結(jié)果如表2所示。

表2 紫外-可見分光光度法和化學(xué)振蕩法測定結(jié)果的比較Table 2 The comparison of the results of UV Vis spectrophotometry and chemical oscillation method

從試驗(yàn)結(jié)果可知，B-Z振蕩法的測定結(jié)果稍低于光度法，說明本研究所提出的方法可用于茶多酚的定量測定。

2.5 沒食子酸（茶多酚）可能的擾動(dòng)機(jī)理

圖3（a）為沒食子酸的分子結(jié)構(gòu)，對(duì)于沒食子酸的化學(xué)振蕩研究，李和興、高執(zhí)棣等認(rèn)為，在振蕩過程中沒食子酸既可作為有機(jī)底物，又可作為金屬離子催化劑，從而構(gòu)成所謂的非催化振蕩體系[12-13]。因此，本研究中在經(jīng)典的B-Z振蕩體系中，另外加入沒食子酸（茶多酚），必然對(duì)原來體系的振蕩參數(shù)產(chǎn)生影響。

圖3 沒食子酸（GA）和EGCG的分子結(jié)構(gòu)Fig.3 The molecular structure of gallic acid（GA）and EGCG

由圖3可知，在B-Z振蕩過程中加入沒食子酸，體系的振蕩周期和振幅都發(fā)生了改變[圖3（b）]。我們認(rèn)為茶多酚在振蕩體系中可能發(fā)生以下3個(gè)過程：1）茶多酚是一種羥基酚類化合物，具有還原性，因此可與B-Z振蕩體系中的氧化性成分（如BrO3-）發(fā)生氧化還原反應(yīng)。此外，茶多酚中的酚羥基作為活潑氫的供體可使反應(yīng)中產(chǎn)生的某些自由基失活，而本身被氧化形成穩(wěn)定的醌類化合物。而這種醌類物質(zhì)所起的作用與沒食子酸類似，可用作B-Z振蕩體系的反應(yīng)底物和催化劑[13]。2）溴單質(zhì)是B-Z振蕩體系中的一種重要的中間產(chǎn)物，容易與親電性的苯環(huán)發(fā)生取代反應(yīng)，因此改變振蕩反應(yīng)的振蕩周期。3）茶多酚中的鄰位二羥基結(jié)構(gòu)可與B-Z體系中作為催化劑的Ce4+離子發(fā)生配位作用，從而改變[Ce4+]/[Ce3+]的比值[9]。根據(jù)電極電位的Nernst方程，茶多酚加入后振幅對(duì)應(yīng)的電位降低，但振蕩波形基本不變，其可能發(fā)生的反應(yīng)為：

3 結(jié)論

本文研究了沒食子酸及茶多酚對(duì)B-Z振蕩體系的影響，建立了一種檢測茶多酚的新方法。與其他方法相比，該方法具有儀器設(shè)備簡單、易于操作、靈敏度高和耗時(shí)少的特點(diǎn)。振蕩機(jī)理的研究表明，茶多酚在酸性的條件下可與體系中存在的氧化性成分發(fā)生氧化作用，與Ce4+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)及與溴發(fā)生取代反應(yīng)，因此改變了體系的振蕩參數(shù)。以上茶多酚的振蕩研究將有助于理解其作用機(jī)制和拓展其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

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