王華，王瑩，詹長(zhǎng)娟，王翼，徐偉，陳海燕

（1.南京理工大學(xué)泰州科技學(xué)院化工學(xué)院，江蘇泰州225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物藥學(xué)院，江蘇泰州225300）

脂肪酶（EC 3.1.1.3）廣泛地用于催化水解[1]、醇解[2]、酯化[3]和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)[4]，是繼蛋白酶、糖基水解酶之后，銷量最大的食品和工業(yè)用酶類，具有廣闊的市場(chǎng)空間和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。研究人員嘗試了利用多種載體來固定脂肪酶，如水滑石[6]、多孔玻璃珠[7]等無機(jī)材料，天然高分子材料殼聚糖[8]、海藻酸鈉[9]，聚偏氟乙烯膜[10]、芳香聚酰胺中空纖維膜[11]及珠狀環(huán)氧乙烷丙烯酸類多孔樹脂[12]等有機(jī)載體。通過吸附法、交聯(lián)吸附、共價(jià)結(jié)合及包埋法等對(duì)南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctica B，CAL.B）、柱狀假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase，CRL）和豬胰脂肪酶（Porcine pancreatic lipase，PPL）等常見脂肪酶進(jìn)行固定化。

本文以黑曲霉脂肪酶（Aspergillus niger lipase）為研究對(duì)象，采用大孔樹脂為載體，通過物理吸附固定化脂肪酶，并對(duì)固定化脂肪酶的性質(zhì)進(jìn)行探討，為脂肪酶的固定化和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

脂肪酶（＞20 000 U/g）：寧夏和氏璧；牛白蛋白（BR）：國(guó)藥集團(tuán)；考馬斯亮藍(lán)-G250（BR）：上海強(qiáng)順化學(xué)；橄欖油（CR）：國(guó)藥集團(tuán)；聚乙烯醇（1750±50）：國(guó)藥集團(tuán)；S-8、AB-8、D101大孔樹脂（孔徑 25 nm～28 nm，粒度0.3 mm～1.25 mm）：國(guó)藥集團(tuán)；其余試劑均為市售分析純。

PHS-25型精密pH計(jì)、UV754N型紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器；AL104型電子天平：梅特勒-托利多；78-1型磁力加熱攪拌器、SHA-8型雙功能水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器。

1.2 脂肪酶的固定化

用0.1 mol/L磷酸緩沖液（PBS）配制20 mg/mL的脂肪酶溶液。在150 mL的錐形瓶中加入5 g預(yù)處理好的大孔樹脂和適量酶液，一定溫度下振蕩數(shù)小時(shí)。抽濾，用磷酸緩沖液沖洗，得固定化脂肪酶。

收集濾液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)出其中的酶蛋白含量，并計(jì)算脂肪酶的固定化率[13]。

脂肪酶固定化率/%=（加入酶的總量-濾液中酶量）/加入酶的總量×100。

1.3 脂肪酶的活力測(cè)定

1.3.1 酶活的定義

在40℃、pH為7.5的條件下，1 s水解產(chǎn)生1 mol脂肪酸所需的脂肪酶酶量定義為一個(gè)活力單位（kat）。

1.3.2 NaOH滴定法測(cè)酶活

將聚乙烯醇與橄欖油（體積比=3∶1）在磁力攪拌器的攪拌下配制成乳化液，將磷酸緩沖溶液和橄欖油乳化液（體積比=5∶4）加入錐形瓶中混勻，在40℃水浴中預(yù)熱5 min，加入適量游離或固定化脂肪酶，40℃反應(yīng)15 min后，立即加入15 mL 95%乙醇以終止脂肪酶的催化反應(yīng)。脂肪酶能將乳化的橄欖油水解成脂肪酸和甘油，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液和酚酞指示劑對(duì)脂肪酸進(jìn)行酸堿滴定至粉紅色。由消耗的NaOH的體積求出脂肪酶的酶活[14]。

固定化脂肪酶的活力回收率/%=固定化脂肪酶活力/（加入游離酶的總活力-濾液中脂肪酶活力）×100。

1.4 大孔樹脂的篩選

取3只150 mL錐形瓶，各加入5 g經(jīng)預(yù)處理的S-8、AB-8和D-101大孔樹脂和10 mL脂肪酶溶液（pH 7.5 PBS配制，20 mg/mL），40℃，振蕩 2 h。分別測(cè)定不同大孔樹脂作為載體的固定化脂肪酶的固定化率和固定化脂肪酶活力回收率。

1.5 固定化脂肪酶性質(zhì)研究

1.5.1 最適反應(yīng)溫度

分別取1 mL脂肪酶液和0.2 g固定化脂肪酶各9份，pH 7.5，在 30、32、34、36、38、40、42、44、46 ℃的條件下，測(cè)算游離和固定化脂肪酶的相對(duì)酶活。

1.5.2 最適反應(yīng)pH

分別取1 mL脂肪酶液和0.2 g固定化脂肪酶各7份，40 ℃，在 pH 為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 下，測(cè)定游離和固定化脂肪酶的相對(duì)酶活。

1.5.3 熱穩(wěn)定性

分別取1 mL肪酶液和0.2 g固定化脂肪酶各7份，在 20、30、40、50、60、70、80 ℃的條件下水浴振蕩 1 h，在40℃、pH 7.5的條件下，測(cè)定游離和固定化脂肪酶的相對(duì)酶活。

1.5.4 酸堿穩(wěn)定性

取0.2 g固定化脂肪酶7份，在pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的條件下水浴振蕩 1 h，過濾后，在40℃、pH 7.5的條件下，測(cè)定游離和固定化脂肪酶的相對(duì)酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔樹脂的選擇

分別以S-8、AB-8、D-101為載體制備的固定化脂肪酶的固定化率和固定化脂肪酶活力回收率見表1。

表1 不同大孔樹脂的固定化脂肪酶的效果Table 1 Effect of various macroporous resin on the activity of lipase

根據(jù)表1可以看出載體的類型對(duì)脂肪酶的固定化率尤其是活力回收率影響較大，以極性大孔樹脂S-8為載體制備的固定化脂肪酶固定化率和活力均為最低。其原因可能是，脂肪酶有較強(qiáng)的疏水性[15-16]，能較好地吸附于弱極性的AB-8樹脂和非極性的D-101樹脂的表面及內(nèi)部孔道[17]?；谙嗤脑颍珹B-8樹脂和D-101樹脂對(duì)非極性底物橄欖油存在較強(qiáng)的吸附作用力，增加了固定化脂肪酶與底物的接觸面積，從而使固定化酶具有相對(duì)高的活力[18]。其中，非極性大孔樹脂D-101在固定化脂肪酶固定化率及活力回收率效果最佳，因此，本文選擇D-101為脂肪酶固定化的載體。

2.2 響應(yīng)曲面法對(duì)固定化脂肪酶技術(shù)的研究

2.2.1 脂肪酶固定化響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以固定化脂肪酶活力回收率（Y）為指標(biāo)，考察pH、溫度、時(shí)間及給酶量等因素對(duì)D-101大孔樹脂固定化脂肪酶的影響，并采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)脂肪酶的固定化工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化[19]。分析因素及水平編碼表見表2，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表2 脂肪酶固定化因素水平表Table 2 Assigned concentrations of variables at different levels in Box-Behnken design for the immobilization of lipase

表3 脂肪酶固定化Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken design for the activity recovery ratio of lipase

對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到活力回收率與pH、溫度、時(shí)間、給酶量之間的二次多元回歸方程：

固定化脂肪酶活力回收率/%=100.41+1.85A-2.71B+2.92C-1.59D+0.67AB+1.87AC-0.63AD-2.92BC+1.74BD+0.020CD-5.10A2-14.88B2-6.21C2-4.51D2

2.2.2 二次多元回歸模型方差分析

活力回收率試驗(yàn)回歸方程方差分析結(jié)果見表4。

表4 活力回收率回歸方程系數(shù)估計(jì)及方差分析Table 4 Analysis of regression coefficient

方程模型的顯著性P＜0.000 1屬極顯著范疇，pH、溫度、時(shí)間和給酶量的影響均為極顯著，二次項(xiàng)BC 以及 A2、B2、C2、D2亦為極顯著，AC、BD 的影響為顯著?；貧w模型的決定系數(shù)R2=0.982 8，校正決定系數(shù)R2(Adj)=0.965 6，表明該回歸方程可很好地描述pH等因素與響應(yīng)值活力回收率之間的相應(yīng)關(guān)系。

2.2.3 固定化脂肪酶活力回收率曲面分析

固定化脂肪酶活力回收率曲面分析見圖1。

從圖1（A～F）中可以知道：6個(gè)響應(yīng)曲面圖均為開口向下的凸形曲面，響應(yīng)值Y隨著每個(gè)因素的改變而發(fā)生變化，其中溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響最大，表現(xiàn)為曲面最陡。這是因?yàn)槊傅鞍组L(zhǎng)時(shí)間在相對(duì)高溫的環(huán)境中，可能會(huì)發(fā)生變性，導(dǎo)致酶活下降。圖 1（B）、1（D）和1（F）中等高線呈橢圓形，表明pH和溫度、給酶量和溫度、時(shí)間和溫度的交互作用比較明顯，與方差分析一致。

圖1 不同因素及其交互作用對(duì)固定化脂肪酶活力回收率的影響Fig.1 Curved surface plots（A～F）for reciprocal effect of each two factors on the activity recovery ratio of lipase

經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析，大孔樹脂固定化脂肪酶的最優(yōu)條件為pH 7.62、38.72℃、4.30 h、給酶量為8.92 mL，固定化脂肪酶活力回收率的預(yù)測(cè)結(jié)果為101.417%?？紤]到試驗(yàn)操作的可控性，在條件為pH7.6、溫度為39℃、時(shí)間為4.3 h、給酶量為9.0 mL的條件進(jìn)行3組重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，其實(shí)際測(cè)得的固定化脂肪酶平均固定化率為95.11%，活力回收率為101.36%，與預(yù)測(cè)值較為接近，驗(yàn)證了響應(yīng)面法回歸模型的合理性。

2.3 固定化脂肪酶性質(zhì)討論

2.3.1 最適反應(yīng)溫度的測(cè)定

最適反應(yīng)溫度的測(cè)定見圖2。

圖2 游離酶和固定化脂肪酶反應(yīng)最適溫度Fig.2 Effect of temperature on lipase activity

由圖2可知，游離脂肪酶的最佳反應(yīng)溫度為38℃，而固定化脂肪酶的最佳反應(yīng)溫度為40℃。溫度低于40℃時(shí)，固定化酶的相對(duì)活力較游離酶低，這是因?yàn)橹久肝接贒-101樹脂孔道中，脂肪酶分子的尺寸為幾個(gè)到十幾個(gè)納米，D-101大孔樹脂的孔徑為25nm～28 nm，底物橄欖油的擴(kuò)散速度受到影響[20-21]，隨著溫度的升高，橄欖油分子運(yùn)動(dòng)速度加快，表現(xiàn)出酶活力迅速增大。溫度繼續(xù)升高，固定化脂肪酶酶的活力下降比游離酶慢，這是因?yàn)槲接贒-101樹脂孔道中的脂肪酶空間構(gòu)象相對(duì)穩(wěn)定，在一定程度上提高了脂肪酶的耐熱性，使脂肪酶能夠在更廣的溫度范圍內(nèi)催化反應(yīng)。

2.3.2 最適pH的測(cè)定

最適pH的測(cè)定見圖3。

圖3 游離酶和固定化脂肪酶反應(yīng)最適pHFig.3 Effect of pH on lipase activity

由圖3可知，在pH＜7.5時(shí)，固定化脂肪酶相對(duì)酶活由酸堿度引起的變化比游離酶大，在pH＞7.5時(shí)，固定化脂肪酶相對(duì)酶活由酸堿度引起的變化比游離酶小。橄欖油水解產(chǎn)生的脂肪酸受到樹脂孔道的擴(kuò)散限制。當(dāng)固定化酶位于酸性環(huán)境中時(shí)，脂肪酶周圍微環(huán)境中短時(shí)間內(nèi)積累較多的脂肪酸，酶活受到抑制，當(dāng)固定化酶位于堿性環(huán)境中時(shí)，產(chǎn)生的脂肪酸可被快速中和，故固定化后，脂肪酶在偏堿性環(huán)境下表現(xiàn)出較強(qiáng)的催化活性[22]。

2.3.3 脂肪酶的熱穩(wěn)定性

脂肪酶的熱穩(wěn)定性見圖4。

圖4 脂肪酶酶的熱穩(wěn)定性比較Fig.4 The plots of thermal stability of the immobilized and free lipase

圖4顯示，在較低的溫度中（＜40℃），游離脂肪酶和固定化脂肪酶的活力都很高，但隨著保溫溫度的提高（＞50℃），游離脂肪酶的相對(duì)酶活驟然下降。說明游離脂肪酶的熱穩(wěn)定性差，固定化脂肪酶熱穩(wěn)定性更好。這是因?yàn)槊附?jīng)固定化后，脂肪酶分子被吸附于大孔樹脂中，酶分子整體運(yùn)動(dòng)受阻，活性中心的穩(wěn)定性增加。

2.3.4 脂肪酶的酸堿穩(wěn)定性

脂肪酶的酸堿穩(wěn)定性見圖5。

圖5 脂肪酶的酶酸堿穩(wěn)定性Fig.5 The plots of pH stability of the immobilized and free lipase

固定化脂肪酶在不同pH條件下保存1 h后，相對(duì)酶活力均維持在70%以上（見圖5），酸堿穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論

本文以D-101大孔樹脂為載體，采用物理吸附法制備了固定化脂肪酶。通過Box-Benhnken原理設(shè)計(jì)了四因素三水平的響應(yīng)曲面試驗(yàn)，優(yōu)化的脂肪酶固定化工藝為：pH 7.6、溫度39℃、時(shí)間4.3 h、給酶量為9.0 mL（20 mg/mL），在此條件下，固定化脂肪酶平均固定化率為95.11%，活力回收率為101.36%。固定化脂肪酶的最適溫度提高2℃和pH無明顯變化，向堿性方向偏移，熱穩(wěn)定性較游離酶有所提高（＞50℃），酸堿穩(wěn)定性好。

以價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定的D-101大孔樹脂為載體，制備的固定化脂肪酶，工藝簡(jiǎn)單，固定化率和酶活回收率高，穩(wěn)定性好，具有較好的工業(yè)前景。

[1] Chowdary G V,Ramesh M N,Prapulla S G.Enzymic synthesis of isoamyl isovalerate using immobilized lipase from Rhizomucor miehei:multivariate analysis[J].Process Biochem,2001,36(4):331-339

[2] Rao P,Divakar S.Lipase catalyzed esterification of a-terpineol with various organic acids:application of the Plackett-Burman design[J].Process Biochem,2001,36(11):1125-1128

[3] Zhang L Q,Zhang Y D,Xu L,et al.Lipase catalyzed synthesis of RGDdiamidein aqueous water-miscibleorganic solvents[J].Enzyme Microb Technol,2001,29(2):129-135

[4] Weber N,Klein E,Mukerjee K D.Long chain acyl thioesters prepared by solvent free thioesterification and transesterification catalyzed by microbial lipases[J].Appl Microbiol Biotechnol,1999,51(3):401-404

[5] 劉光.黑曲霉脂肪酶的分離純化及其性質(zhì)研究[D].廣州:華南理工大學(xué),2013

[6] Sagiroglu A.Conversion of sunflower oil to biodiesel by alcoholysis using immobilized lipase[J].Artificial Cells Blood Substitutes and Biotechnology,2008,36(2):138-149

[7] 羅文,譚天偉,袁振宏,等.多孔玻璃珠固定化脂肪酶及其催化合成生物柴油[J].現(xiàn)代化工,2007,21(11):40-42

[8] 吳茜茜,吳克,劉斌,等.殼聚糖固定化德氏根霉脂肪酶的研究[J].工業(yè)微生物,2003,33(4):9-13

[9] López Serrano P,Cao L,van Rantwijk F,et al.Cross-linked enzyme aggregates with enhanced activity:application to lipases[J].Biotechnology Letters,2002,24(16):1379,1383

[10]Tsai S W,Shaw S S.Selection of hydrophobic membranes in the lipase-catalyzed hydrolysis of olive oil[J].Journal of Membrane Science,1998,146(1):l-8

[11]Sakaki K,Giorno L,Drioli E.Lipase-catalyzed optical resolution of racemic naproxen in biphasic enzyme membrane reactors[J].Journal of Membrane Science,2001,184(1):27-38

[12]Vaidya B K,Ingavle G C,Ponrathnam S,et al.Immobilization of Candida rugosa lipase on poly(allyl glycidyl ether-co-ethylene glycol dimethacrylate)macroporous polymer particles[J].Bioresource Technology,2008,99(9):3623-3629

[13]王華,王安明,周成,等.微波輻射高效共價(jià)固定青霉素?；竅J].化學(xué)學(xué)報(bào),2008,66(2):271-275

[14]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 23535-2009脂肪酶制劑[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009

[15]波萊納J,麥凱布A.P.工業(yè)酶——結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社,2010

[16]徐堅(jiān),王玉軍,駱廣生,等.膜材料的親疏水性對(duì)固定化脂肪酶的影響[J].高校化學(xué)工程學(xué)報(bào),2006,20(3):395-400

[17]萬容兵.載體表面化學(xué)組成對(duì)蛋白質(zhì)吸附行為的影響[D].浙江理工大學(xué),2010

[18]劉汝寬.脂肪酶固定化技術(shù)研究[D].鄭州:河南工業(yè)大學(xué),2007

[19]徐向宏,何明珠.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與Design-Expert、SPSS應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社,2010

[20]賈佳,尹德忠,張寶亮,等.大孔樹脂固定木瓜蛋白酶的研究[J].材料導(dǎo)報(bào),2013,27(22):88-91

[21]曹林秋.載體固定化酶-原理、應(yīng)用和設(shè)計(jì)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2008

[22]羅貴明.酶工程[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003