劉華鼐，李瓊，葉勇

（華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州510641）

茶葉籽是山茶屬植物茶（L）即茶樹的果實(shí)，是茶葉生產(chǎn)的副產(chǎn)物。我國(guó)茶葉籽資源十分豐富，年產(chǎn)量約為80余萬(wàn)噸，大部分用于榨取茶油，剩余的副產(chǎn)品中含有很多有效成分，如茶皂素、茶多糖、黃酮等，可研究利用價(jià)值很高。目前在國(guó)內(nèi)對(duì)茶皂素、茶多糖的研究多見，而茶籽中黃酮的提取研究鮮見報(bào)道。黃酮類化合物可以防止心血管、腦血管和呼吸系統(tǒng)疾病，還有消炎，抑菌，抗糖尿病，抗輻射，抗癌，抗腫瘤和增強(qiáng)免疫等藥理作用，同時(shí)也是重要的功能食品添加劑、天然抗氧化劑、天然色素等。黃酮類化合物的提取方法主要有水和溶劑浸提法[1-2]、超聲波法和微波輔助提取法[3-4]、以及酶解法[5]等。

響應(yīng)面分析法（RSM）是由Box—Wilson開發(fā)的一種綜合的數(shù)學(xué)建模、數(shù)據(jù)分析方法，主要用于化學(xué)過(guò)程中多個(gè)因素的因子優(yōu)化。通過(guò)響應(yīng)面法，可以對(duì)單個(gè)變量因子對(duì)目標(biāo)變量的影響進(jìn)行分析，也可以對(duì)多個(gè)試驗(yàn)變量的最優(yōu)搭配進(jìn)行精確的數(shù)學(xué)估計(jì)，確定最優(yōu)的因子條件。響應(yīng)面法對(duì)工藝條件的優(yōu)化具有更加可靠的數(shù)學(xué)依據(jù)支持，對(duì)最優(yōu)條件的探索能精確到最具體的值，可以彌補(bǔ)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)等方法的缺陷[6]。

本試驗(yàn)以茶籽為原料，采用乙醇作為溶劑提取黃酮，研究了液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響；通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件。不但提高了茶籽中黃酮的提取率，而且極大地縮短了提取周期，該研究將利于茶籽的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

油茶籽：湖南茶農(nóng)業(yè)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)sigma公司。

石油醚60～90、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硒酸鈉、乙醇，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

DZF-6050真空干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；UV-2800紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯上海儀器有限公司；WD-9419粉碎器：北京華運(yùn)安特；JY10001分析電子天平：上海高致密儀器；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 茶籽黃酮提取與分離工藝流程

茶葉籽去殼、干燥、粉碎，過(guò)60目篩得干粉。再取適量經(jīng)過(guò)前處理的茶籽干粉，置于索氏提取器中用石油醚進(jìn)行除油；然后取去油粉末3.000 g置于錐形瓶中用乙醇進(jìn)行回流提取，一定時(shí)間后趁熱抽濾即得黃酮提取液。

1.4 方法

1.4.1 黃酮測(cè)定方法

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣為基準(zhǔn)，采用硝酸鋁絡(luò)合-紫外分光光度法測(cè)定茶籽黃酮含量。所得蘆丁濃度（X）與吸光度（Y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線適用范圍為（0～100 μg/mL）：Y=11.271X-0.010 7，R2=0.998 4。

1.4.2 單因素試驗(yàn)

影響黃酮得率的因素比較多，本實(shí)驗(yàn)主要從液料比、提取溫度、提取時(shí)間及乙醇的濃度等幾個(gè)方面進(jìn)行單因素試驗(yàn)。初步確定較佳的提取工藝條件。

1.4.3 響應(yīng)面法優(yōu)化茶籽黃酮提取條件研究

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選定乙醇濃度、液料比、提取溫度為考察因子，采用響應(yīng)面法，在三因素三水平上對(duì)茶籽黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面因素水平編碼表如表1所示。

表1 水平編碼表Table 1 Level code of each factor

1.4.4 數(shù)據(jù)分析

采用Desing-Expert8.0.5軟件對(duì)響應(yīng)面的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合、方差分析、顯著性檢測(cè)和響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及其分析

乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)黃酮得率的影響見圖1所示。

圖1 乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)黃酮得率的影響Fig.1 Effects of the ethanol concentration，the ratio of solid and solution，the time，and the temperature on the yield of total flavonoids

由圖1可知，由茶籽中提取黃酮較佳的工藝條件為：在80℃的溫度下，液料比為 25∶1（mL/g），乙醇濃度60%，提取2 h。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[7-9]，選定提取溫度，乙醇濃度和液料比作為考察因素（因?yàn)? h后提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響不大，故設(shè)定2 h為最佳條件，不再進(jìn)行考察）。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)曲面分析法進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。通過(guò)Design Expert軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及對(duì)模型進(jìn)行方差分析，得到以下回歸方程：Y=-59.064 68+0.524 36X1+1.001 08X2+1.476 37X3+0.001 752 52X1X2+0.003 396 7X1X3-0.006 230 85X2X3-0.004 616 08X12-0.007 971 38X22-0.023 330X32，式中：Y 為黃酮的提取率，mg/g；X1為提取溫度，℃；X2為乙醇濃度，%；X3為液料比，mL/g。

該方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小直接反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。由于該方程的二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，可以推斷方程代表的拋物面開口向下，因而具有極大值點(diǎn)，可以進(jìn)行優(yōu)化分析。由方程的一次項(xiàng)系數(shù)可以得出，影響茶籽黃酮提取率的主次順序?yàn)椋阂毫媳龋疽掖紳舛龋咎崛囟取?/p>

2.2.2 回歸方程的方差分析及系數(shù)顯著性分析

回歸模型方差分析見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化回歸方程的方差分析Fig.2 Variance analysis of regression equation

由表2可知，F(xiàn)值=27.7，P值為0.000 1，說(shuō)明該模型是有效可靠的，達(dá)到極顯著水平（P＜0.001），有意義。失擬項(xiàng)是模型與實(shí)驗(yàn)擬合程度的標(biāo)準(zhǔn)，本次模擬中失擬項(xiàng)的P值為0.052 9＞0.05，不顯著，對(duì)模型有利。R2=0.972 7，說(shuō)明該模型能解釋97.27%響應(yīng)值的變化，R2Adj=0.937 6，說(shuō)明可信度較好，因此可以運(yùn)用該擬合模型對(duì)對(duì)茶葉籽中總黃酮的提取率進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

2.3 茶籽黃酮提取率的響應(yīng)面分析圖

響應(yīng)面分析圖是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子A、B、C所構(gòu)成的響應(yīng)面圖形。從響應(yīng)面分析圖可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。當(dāng)特征值均為正值時(shí)，響應(yīng)圖為山谷形曲面，有極小值；當(dāng)特征值為負(fù)值時(shí)，為山丘形曲面，有極大值存在；當(dāng)特征值有正有負(fù)時(shí)，為馬鞍形曲面，無(wú)極值存在。本試驗(yàn)根據(jù)回歸方程進(jìn)行不同因子的響應(yīng)面分析，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，馬鞍形或者橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。

圖2為各因素對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖A。

對(duì)比3個(gè)響應(yīng)面的形狀及參數(shù)，以及等高線分析，可以看出，響應(yīng)面順著液料比的方向的陡度最大，結(jié)合方差分析，可以得出液料比在交互作用中對(duì)茶籽黃酮提取率的影響最顯著，乙醇濃度的影響次之，提取溫度的影響作用不夠顯著。對(duì)茶籽黃酮的提取率的影響的顯著性大小如下：液料比＞乙醇濃度＞提取溫度。

圖2 各因素及其交互作用對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面曲面圖Fig.2 The effect of various factors and interaction on the yield of total flavonoids

利用RMS預(yù)測(cè)，通過(guò)對(duì)各個(gè)響應(yīng)面的最高點(diǎn)的極值分析，通過(guò)對(duì)最高點(diǎn)取值，并對(duì)多元二次回歸方程進(jìn)行求解，得出各個(gè)因子的解，這個(gè)值即是最優(yōu)工藝條件為：提取液料比為28.52∶1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)濃度59.76%，提取溫度為77.91℃，在此條件下總黃酮提取2 h的理論值為13.342 4 mg/g。

2.4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design-Expert軟件分析回歸模型，在各因素編碼水平范圍內(nèi)，得出茶籽黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)：液料比28∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù) 60%、提取溫度 78℃，提取時(shí)間2h。為驗(yàn)證Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，5次平行試驗(yàn)所得茶籽黃酮平均得率為12.158 mg/g。與理論預(yù)測(cè)值誤差為8.8%，表明該優(yōu)化參數(shù)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到水提取茶籽黃酮的最優(yōu)工藝條件是液料比28∶1（mL/g）、乙醇濃度60%、提取溫度78℃，提取時(shí)間2 h，測(cè)得的總黃酮平均含量為12.158 mg/g。得出結(jié)論液料比對(duì)總黃酮的提取率影響最大。因此，該研究結(jié)果對(duì)茶籽黃酮在茶籽綜合利用領(lǐng)域的深入開發(fā)提供了一定理論依據(jù)和參考。

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