吳明霞，劉瑞芳，方小淋

（寧德師范學(xué)院生物系，福建寧德352100）

蘋果酒以蘋果為原料發(fā)酵而成[1]，含大量營養(yǎng)成分，口味柔和，是一種老少皆宜的飲品，成為蘋果深加工產(chǎn)業(yè)中的寵兒。利用蘋果生產(chǎn)出不同口味、不同系列的蘋果酒，從外觀、營養(yǎng)、穩(wěn)定性方面符合消費(fèi)者選擇度，滿足不同消費(fèi)群體的需求，成為今后幾年我國果酒開發(fā)的主要方向。

我國大規(guī)模生產(chǎn)蘋果酒起步較晚，正處于發(fā)展階級(jí)，技術(shù)水平與發(fā)達(dá)國家成熟的釀造行業(yè)相比相對(duì)薄弱，存在一些急待解決的問題。其中澄清處理直接關(guān)系到蘋果酒的穩(wěn)定性和貯存時(shí)間，也很大程度上影響蘋果酒的品質(zhì)風(fēng)味，如何獲得理想的澄清效果又不減少其營養(yǎng)成分是影響蘋果酒發(fā)展的一個(gè)重要問題，需不斷進(jìn)行探索研究。

采用殼聚糖、皂土、蛋清、果膠酶四種不同單一澄清劑及復(fù)合澄清劑處理蘋果酒，確定最佳澄清劑添加量，并對(duì)其理化指標(biāo)進(jìn)行檢測，以期獲得合適的澄清劑和維持蘋果酒澄清穩(wěn)定性的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

殼聚糖：青島潛光生物工程有限公司；皂土：齊齊哈爾臺(tái)龍食品有限公司；果膠酶：天津市利華酶制劑廠；安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；VC：大同市云崗制藥有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250：上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠。

1.2 儀器

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GR60DA高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；PK-DB電熱恒溫水槽：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；L550臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；JYZ-B550九陽榨汁機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 蘋果酒制作工藝流程

1.3.2 澄清劑的配制

1%殼聚糖：稱取1 g檸檬酸，加入98 mL蒸餾水加熱溶解，再加入1 g殼聚糖，攪拌溶解，配成1%殼聚糖溶液，冷卻備用[2]。

1%皂土：稱取1 g皂土，加入100 mL蒸餾水浸泡24 h，攪拌均勻，皂土吸水膨脹后形成膠體懸浮液備用[3]。

20%蛋清液：取一新鮮雞蛋的蛋清20 mL，加1 g NaCl后用蒸餾水調(diào)勻，定容至100 mL，備用。

1%果膠酶：稱取1 g果膠酶，先用50 mL 40℃溫水溶解后，再加入到50 mL溫水中稀釋，搖勻攪拌，配制成1%的果膠酶溶液，放置1 h～2 h后備用[4]。

1.3.3 單一澄清劑的澄清試驗(yàn)

1.3.3.1 殼聚糖的澄清試驗(yàn)

取蘋果原酒20mL5份于小燒杯中，分別加入1%、2%、3%、4%、5%（體積分?jǐn)?shù)）配制好的1%殼聚糖溶液，充分?jǐn)嚢瑁帽ｕr膜封口，在冷處理（0℃）和非冷處理（20℃）條件下靜置24 h后，取其上清液離心（4 000 r/min，15 min），以蒸餾水為空白，不添加任何澄清劑的蘋果酒為對(duì)照，測定透光率和吸光值。

1.3.3.2 皂土的澄清試驗(yàn)

取蘋果原酒20 mL 5份于小燒杯中，分別加入2%、4%、6%、8%、10%（體積分?jǐn)?shù)）配制好的1%皂土溶液，充分?jǐn)嚢瑁帽ｕr膜封口，在冷處理（0℃）和非冷處理（20℃）條件下靜置24 h后，取其上清液離心（4 000 r/min，15 min），以蒸餾水為空白，不添加任何澄清劑的蘋果酒為對(duì)照，測定透光率和吸光值。

1.3.3.3 蛋清的澄清試驗(yàn)

取蘋果原酒20 mL 5份于小燒杯中，分別加入0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%（體積分?jǐn)?shù)）配制好的蛋清液，充分?jǐn)嚢?，用保鮮膜封口，在冷處理（0℃）和非冷處理（20℃）條件下靜置24 h后，取其上清液離心（4 000 r/min，15 min），以蒸餾水為空白，不添加任何澄清劑的蘋果酒為對(duì)照，測定透光率和吸光值。

1.3.3.4 果膠酶的澄清試驗(yàn)

取蘋果原酒20mL5份于小燒杯中，分別加入1%、2%、3%、4%、5%（體積分?jǐn)?shù)）配制好的1%果膠酶溶液，充分?jǐn)嚢?，用保鮮膜封口，在冷處理（0℃）和非冷處理（20℃）條件下靜置24 h后，取其上清液離心（4 000 r/min，15 min），以蒸餾水為空白，不添加任何澄清劑的蘋果酒為對(duì)照，測定透光率和吸光值。

1.3.4 復(fù)合澄清劑的澄清試驗(yàn)

在以上單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取澄清效果較好的3種澄清劑進(jìn)行兩兩復(fù)合，按相同比例添加量，對(duì)蘋果酒進(jìn)行復(fù)合澄清處理，以冷處理和非冷處理?xiàng)l件下澄清后的蘋果酒透光率為檢測指標(biāo)。

1.3.5 蘋果酒非生物穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.3.5.1 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性試驗(yàn)[5]

1.3.5.2 酒石酸氫鉀穩(wěn)定性試驗(yàn)[5]

1.3.5.3 鐵穩(wěn)定性試驗(yàn)[5]

1.3.5.4 銅穩(wěn)定性試驗(yàn)[5]

1.3.5.5 氧化穩(wěn)定性試驗(yàn)[5]

1.3.6 理化指標(biāo)的檢測方法

1.3.6.1 透光率T

采用分光光度計(jì)法，以蒸餾水作空白，取澄清分離后的酒液，在波長720 nm的光波處測定透光率T[6]。

1.3.6.2 吸光度A

采用分光光度計(jì)法，以蒸餾水作空白，取澄清分離后的酒液，在波長450 nm的光波處測定吸光度A[7]。

1.3.6.3 蛋白質(zhì)含量

考馬斯亮蘭G250法[8-9]。

1.3.6.4 總酚含量

福林-肖卡法[10]。

1.3.6.5 酒精度

酒精計(jì)法[11]。

1.3.6.6 殘?zhí)橇?/p>

斐林試劑滴定法[12]。

1.3.6.7 總酸

酸堿中和滴定法[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一澄清劑對(duì)蘋果酒澄清效果的影響

2.1.1 殼聚糖對(duì)蘋果酒的澄清效果

殼聚糖對(duì)蘋果酒的澄清效果見圖1、圖2。

圖1 殼聚糖添加量對(duì)透光率的影響Fig.1 The content of chitosan effect on light transmittance

圖2 殼聚糖添加量對(duì)吸光值的影響Fig.2 The content of chitosan effect on the absorbance values

由圖1可知，在冷處理和非冷處理?xiàng)l件下，隨著殼聚糖添加量的增加，蘋果酒透光率的變化趨勢都是先增加后下降。當(dāng)常溫添加量達(dá)4%時(shí)，澄清效果最好，透光率高達(dá)99.79%；當(dāng)添加量小于等于3%時(shí)，冷處理的效果比非冷處理的效果好。這是因?yàn)闅ぞ厶窃谒嵝跃埔褐行纬烧姾煞肿?，與酒中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)、果膠等微粒相互作用，使引起酒液混濁的膠形顆粒絮凝沉淀下來。若再增加用量，過量的殼聚糖部分溶解于酒中，帶入新的渾濁，再加上其本身凝膠作用，反而使透光率下降。由圖2中可知，加入殼聚糖澄清劑后，蘋果酒的吸光度明顯降低，說明殼聚糖吸附了酒中的色素，使得酒液色澤變淺。添加量高達(dá)5%時(shí)吸光值的增高，也許是過量的殼聚糖使酒液返渾引起的。因此，殼聚糖最佳添加量為冷處理3%。

2.1.2 皂土對(duì)蘋果酒的澄清效果

皂土對(duì)蘋果酒的澄清效果見圖3、圖4。

圖3 皂土添加量對(duì)透光率的影響Fig.3 The content of bentonite effect on light transmittance

圖4 皂土添加量對(duì)吸光值的影響Fig.4 The content of bentonite effect on the absorbance values

由圖3可知，皂土能使蘋果原酒透光率增大，同時(shí)冷處理比未冷處理的透光率高。常溫處理時(shí)，皂土添加量為8%時(shí)透光率最高為98.99%；但隨著添加量的增加，透光率下降，可能是因?yàn)榫浦械牡鞍踪|(zhì)被皂土沉淀完全，過量的皂土懸浮液本身會(huì)引起酒的渾濁。冷處理時(shí)，透光率隨添加量增加也緩慢提高，當(dāng)添加量達(dá)到6%時(shí)，透光率最高為99.32%。這可能是蘋果酒里含有的蛋白質(zhì)比較多，皂土懸浮液中帶負(fù)電荷的膠體細(xì)粒和酒中帶正電荷的蛋白質(zhì)等物質(zhì)相互作用，產(chǎn)生絮凝沉淀，從而達(dá)到澄清目的。由圖4可知，和原酒相比，皂土澄清后的蘋果酒吸光值明顯下降，表明皂土還可以吸收蘋果酒中的色素。因此，皂土最佳添加量為冷處理的6%。

2.1.3 蛋清對(duì)蘋果酒的澄清效果

蛋清對(duì)蘋果酒的澄清效果見圖5、圖6。

圖5 蛋清液添加量對(duì)透光率的影響Fig.5 The content of egg white effect on light transmittance

圖6 蛋清液添加量對(duì)吸光值的影響Fig.6 The content of egg white effect on the absorbance values

由圖5可知，蛋清冷處理的澄清效果明顯優(yōu)于未冷處理，透光率都在97.5%以上。冷處理中，在添加量為2%時(shí)，蛋清溶液透光率升至98.92%，比原酒透光率提高3.89%，而未冷處理時(shí)，最佳蛋清添加量為1.5%，透光率97.01%，這可能是因?yàn)槔涮幚硎拱l(fā)酵后酒中殘留的蛋白質(zhì)、死酵母、果膠等物質(zhì)加速沉淀使透光率升高，同時(shí)能與蘋果酒中的酚類物質(zhì)結(jié)合，吸附酒中混濁微粒使其成為小片狀物而被除去，因而透光率增高。當(dāng)添加量再增大，透光率有下降的趨勢，原因可能是吸附達(dá)到飽和狀態(tài)后，酒液中游離清蛋白增加影響透光率。由圖6可知，冷處理的吸光值比未冷處理的吸光值低，說明冷處理有利于色素析出，能夠改善酒體的色澤。因而，蛋清液的最佳添加量為冷處理的2%。

2.1.4 果膠酶的澄清效果

果膠酶對(duì)蘋果酒的澄清效果見圖7、圖8。

圖7 果膠酶添加量對(duì)透光率的影響Fig.7 The content of pectinase effect on light transmittance

圖8 果膠酶添加量對(duì)吸光值的影響Fig.8 The content of pectinase effect on the absorbance values

由圖7可知，用果膠酶處理的蘋果酒，澄清效果不理想，最高的透光率才97.89%。當(dāng)果膠酶添加量為2%時(shí)，冷處理和常溫處理的透光率都達(dá)到最高值。果膠酶添加量小于等于2%時(shí)，果酒透光率迅速提高，原因可能是果膠酶能使不溶性大分子物質(zhì)和果肉微粒失去膠體保護(hù)作用而發(fā)生共聚沉淀，達(dá)到澄清目的。但當(dāng)添加量大于2%時(shí)，透光率開始下降，也許是果膠降解所得的低分子物質(zhì)改變了酒的pH，從而影響果膠酶的效用。由圖8可知，冷處理的吸光度明顯小于未冷處理吸光度，說明冷處理的果膠酶可以吸附酒中的色素，使得酒的色澤相對(duì)變淺。因此果膠酶添加量2%為最適添加量。

2.1.5 單一澄清劑的比較

4種單一澄清劑對(duì)蘋果酒的澄清效果見圖9。

圖9 4種單一澄清劑對(duì)透光率的影響Fig.9 Four single clarifying agent's influence on light transmittance

由圖9可知，4種澄清劑都一定程度地提高了蘋果酒的透光率，其中殼聚糖的澄清效果最好，皂土次之，果膠酶最差。從成本上考慮，殼聚糖雖然澄清效果很好，但是成本高；皂土價(jià)格便宜，但是配制麻煩。因此可以選擇效果好的3種澄清劑進(jìn)行兩兩復(fù)合試驗(yàn)，以期得到成本低、澄清好、用量少的新型復(fù)合澄清劑。

2.2 復(fù)合澄清劑對(duì)蘋果酒澄清效果的影響

2.2.1 同比例添加量的3種復(fù)合澄清劑澄清效果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，殼聚糖和皂土單獨(dú)使用時(shí)有較好的澄清效果，結(jié)合成本的考慮，選用殼聚糖、皂土和蛋清3種澄清劑復(fù)合澄清使用，以達(dá)到互相補(bǔ)充提高澄清效果的作用見表1。

表1 復(fù)合澄清劑添加量對(duì)透光率的影響Table 1 The amount of compound clarifying agent influence on light transmittance

由表1可知，冷處理可加速蘋果酒的澄清。冷處理時(shí)，殼聚糖-皂土的透光率最高，達(dá)到99.79%，高于皂土單一澄清劑的最佳透光率。雖然低于殼聚糖冷處理時(shí)3%添加量的透光率（為99.90%），不過殼聚糖-皂土復(fù)合澄清劑可以減少殼聚糖添加量，降低了成本而又能達(dá)到良好的澄清效果。未冷處理時(shí)，殼聚糖-蛋清復(fù)合澄清劑比蛋清澄清效果好，但是比殼聚糖澄清效果差，可能是殼聚糖和蛋清在發(fā)生吸附和電性中和作用時(shí)相互影響的原因。因此殼聚糖-皂土復(fù)合澄清劑為最佳復(fù)合澄清劑。

2.2.2 殼聚糖-皂土復(fù)合澄清劑澄清效果

殼聚糖-皂土復(fù)合澄清劑對(duì)蘋果酒透光率的影響見表2。

表2 殼聚糖-皂土復(fù)合澄清劑對(duì)透光率的影響Table 2 The compound clarifying agent of Chitosan-bentonite effect on light transmittance

由表2可知，當(dāng)添加殼聚糖1%-皂土3%時(shí)，透光率最高，冷處理時(shí)為99.88%，未冷處理時(shí)為99.56%，比未冷處理的單一澄清效果都好。說明皂土帶負(fù)電的膠體微粒有效地吸附了帶正電荷的混濁物，而殼聚糖形成帶正電荷分子沉淀酒體帶負(fù)電荷的混濁顆粒，與皂土互補(bǔ)作用，因而在合適添加量下可以達(dá)到比單一澄清劑更好的效果。另外，冷處理對(duì)于澄清度的提高具有顯著的作用，可以加速混濁物質(zhì)的凝聚沉淀，從而使酒體更加清澈透明。同時(shí)，添加殼聚糖1%-皂土5%比添加殼聚糖1%-皂土3%的澄清效果差，這是因?yàn)樵硗恋拇嬖谑固O果酒出現(xiàn)返渾。

此外，采用不同添加比例的殼聚糖-皂土-蛋清復(fù)合澄清劑的澄清試驗(yàn)，透光率較原酒有一定提高，但是遠(yuǎn)不及單一澄清劑和兩種澄清劑復(fù)合的效果，這可能是因?yàn)?種澄清劑將酒體變成更為復(fù)雜的膠體溶液，反而嚴(yán)重影響絮凝渾濁成分，因而對(duì)3種澄清劑復(fù)合不進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 不同澄清劑處理對(duì)蘋果酒基本指標(biāo)的影響

為防止蘋果酒的澄清試驗(yàn)對(duì)蘋果酒成分的影響，測定蘋果酒澄清后的酒精度、殘?zhí)恰⒖偹岬然局笜?biāo)結(jié)果見表3。

表3 不同澄清劑澄清處理對(duì)蘋果酒基本指標(biāo)的影響Table 3 Different clarifying agent clarify deals effect on basic indicators of cider

續(xù)表3 不同澄清劑澄清處理對(duì)蘋果酒基本指標(biāo)的影響Continue table 3 Different clarifying agent clarify deals effect on basic indicators of cider

由表3可知，澄清劑處理后的蘋果酒的酒度、總糖和總酸基本變化不大，保持了蘋果原酒的風(fēng)味。試驗(yàn)得出的含酸量為2.4 g/L～2.5 g/L，符合國家標(biāo)準(zhǔn)。添加了殼聚糖的蘋果酒，其總酸含量有所增加，可能是因?yàn)榕渲茪ぞ厶菚r(shí)有用檸檬酸處理過，但不會(huì)影響蘋果酒的風(fēng)味。果膠酶處理蘋果酒的含酸量比有少量提高，這可能是因?yàn)楣z酶在軟化果酒中的果膠質(zhì)將其分解為半乳糖醛酸和果膠酸。經(jīng)澄清劑處理后的蘋果酒，糖量變化不大，其中殼聚糖的殘?zhí)橇繒?huì)高一些，可能和殼聚糖本質(zhì)是氨基葡萄糖的直鏈多聚糖有關(guān)。因此，可以采用澄清劑澄清蘋果酒不會(huì)影響果酒的風(fēng)味。

2.4 不同澄清劑降酚和降蛋白效果

研究[14]證明，用果實(shí)釀造而成的酒品中會(huì)含有較多的蛋白質(zhì)和多酚類物質(zhì)，在一定條件下，多酚類物質(zhì)會(huì)與蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物而沉淀，從而引起非生物性渾濁，嚴(yán)重影響蘋果酒色澤及風(fēng)味。研究不同澄清劑在冷處理?xiàng)l件下降酚及降蛋白效果見表4。

表4 不同澄清劑對(duì)蘋果酒的降酚及降蛋白效果Table 4 Different clarifying agent of the amount of phenol and protein reduction effect of cider

由表4可知，澄清劑的添加都能使酒中的酚類物質(zhì)含量比原酒有所降低，也降低了果酒的蛋白質(zhì)含量。其中，殼聚糖的降蛋白效果最為顯著，從處理前的290 mg/L下降到69 mg/L，而蛋清的降蛋白效果最差。這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的下降與澄清劑的吸附作用有關(guān)。皂土的降酚效果最好，表明皂土吸附酚類物質(zhì)的作用比吸附蛋白質(zhì)要強(qiáng)。而殼聚糖分子鏈上的羥基和氨基官能團(tuán)，對(duì)蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)合作用大于對(duì)酚類物質(zhì)的作用。

2.5 不同澄清劑對(duì)蘋果酒非生物穩(wěn)定性的影響

蘋果酒穩(wěn)定性是其保持品質(zhì)的關(guān)鍵性質(zhì)。因此，需考察澄清劑對(duì)蘋果酒的非生物穩(wěn)定性的作用，見表5。

表5 蘋果酒的穩(wěn)定性Table 5 The stability test result of cider

由表5可知，單一澄清劑和復(fù)合澄清劑處理過的蘋果酒的非生物穩(wěn)定性各項(xiàng)結(jié)果均呈陰性。酒石酸氫鉀表現(xiàn)穩(wěn)定，是因?yàn)樘O果酒中的有機(jī)酸為蘋果酸，酒石酸含量較低；鐵、銅穩(wěn)定性試驗(yàn)呈陰性，說明發(fā)酵過程中使用玻璃瓶，起到了防止鐵性破敗和銅性破敗的作用，氧化穩(wěn)定性試驗(yàn)呈陰性，表明酒液中的多酚類物質(zhì)被澄清劑吸附減少，使被氧化聚合改變結(jié)構(gòu)而絮凝析出，同時(shí)還可以說明在原料預(yù)處理中添加VC不但起到了護(hù)色作用，還起到了防止蘋果酒發(fā)生氧化的效果。皂土可以吸附沉淀鐵離子，提高抗鐵破敗的能力，這些物質(zhì)的減少提高了蘋果酒的穩(wěn)定性。因此，添加澄清劑能提高蘋果酒非生物穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

1）單一澄清劑

殼聚糖、皂土、蛋清有良好的澄清效果，其中殼聚糖的澄清效果最理想，添加量為3%并經(jīng)過冷處理時(shí)，透光率可達(dá)到99.90%，果膠酶效果最差。經(jīng)過澄清處理后的蘋果酒理化指標(biāo)變化不大。

2）復(fù)合澄清劑

復(fù)合澄清劑的澄清效果殼聚糖-皂土復(fù)合澄清劑澄清效果最好，能優(yōu)于單一澄清劑，最佳添加量比例為殼聚糖1%～皂土3%。這種復(fù)合澄清劑既節(jié)省了成本，又能達(dá)到好的澄清效果，適合生產(chǎn)中使用。經(jīng)復(fù)合澄清劑處理后的蘋果酒的理化指標(biāo)變化不大，果酒顏色變透明，有利于蘋果酒的穩(wěn)定與保存。

3）非生物穩(wěn)定性

殼聚糖降蛋白效果最好，皂土的降酚效果最好。澄清后的蘋果酒蛋白質(zhì)、酒石酸氫鉀、鐵、銅以及氧化穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果均呈陰性，表明單一和復(fù)合澄清劑能提高蘋果酒的非生物穩(wěn)定性。另外，冷處理有助于澄清和吸附色素，其澄清效果明顯優(yōu)于未冷處理。

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