吳德松，劉 佳，韋 迪，趙道強(qiáng)，周銘濤，馮莉萍

(云南省藥物研究所，云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111)

·實(shí)驗(yàn)研究·

虎掌草醇提物抗腫瘤活性及免疫調(diào)節(jié)作用研究*

吳德松，劉 佳，韋 迪，趙道強(qiáng)，周銘濤，馮莉萍△

(云南省藥物研究所，云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111)

目的 觀察虎掌草醇提物的抗腫瘤活性及對荷瘤小鼠免疫功能的影響，并對其安全性進(jìn)行初步評價。方法 改良MTT法檢測虎掌草醇提物對人HepG-2、K562、A549和PC-3細(xì)胞株的增殖抑制活性；采用小鼠移植性腫瘤模型，研究虎掌草醇提物對小鼠肝癌H22生長的影響；免疫器官稱重法檢測對荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響；ELISA法檢測荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-a水平；小鼠急性毒性試驗(yàn)初步評價虎掌草醇提物的安全性。結(jié)果 虎掌草醇提物在體外對人腫瘤細(xì)胞株具有明顯的增殖抑制活性，其IC50值均小于10 μg/mL；虎掌草醇提物1.0、2.0 g/kg劑量可明顯抑制小鼠肝癌H22的生長，同時對小鼠體重?zé)o明顯影響；虎掌草醇提物可明顯提升小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，可明顯提升小鼠血清TNF-α和IL-2水平?；⒄撇荽继嵛镄∈蠊辔附o藥LD50為6.218 g/kg，95%可信限為5.104 g/kg～7.526 g/kg，其毒性可能涉及的組織、器官、系統(tǒng)為中樞神經(jīng)、神經(jīng)肌肉、自主神經(jīng)和肺臟功能損傷。結(jié)論 虎掌草醇提物具有明顯的體內(nèi)、外抗腫瘤活性，其活性可能與增強(qiáng)動物免疫力，提升小鼠血清IL-2、TNF-α水平有關(guān)。

虎掌草；抗腫瘤；免疫調(diào)節(jié)

虎掌草(AnemonerivularisBuch.-Ham.)為毛茛科銀蓮花屬植物草玉梅的根，主要分布于甘肅西南、青海、云南、四川、西藏等地，具有清熱解毒、活血舒筋、消腫止痛等功效[1]，在《滇南本草》和《中華本草》中均有記載。據(jù)《云南中草藥》記載，虎掌草在民間可用于癌癥的治療[2]，提示虎掌草可以具備一定開發(fā)價值。國內(nèi)、外對其抗腫瘤活性研究還主要停留在體外活性研究方面，其體內(nèi)抗腫瘤活性和安全性的研究鮮有報導(dǎo)?；谏鲜隹紤]，筆者對虎掌草提取物進(jìn)行更深入的抗腫瘤活性研究及初步的安全性評價，希望為治療惡性腫瘤提供一種有苗頭的藥物，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供藥效學(xué)研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康KM小鼠，全雌性，體重18～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2008-0002。

1.2 細(xì)胞株與瘤株 人肝癌HepG-2、人慢性骨髓性白血病K562、人肺癌A549和人前列腺癌PC-3細(xì)胞株均購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。小鼠肝癌H22瘤株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.3 樣品制備 取虎掌草藥材打粉，5倍量的70%乙醇回流提取三次，合并濾液，濾液減壓濃縮，真空干燥，粉碎，得到干浸膏，得率為31.1%，常溫干燥密封保存。

1.4 儀器與試劑 AG-285型電子分析天平、DMIL-LED型倒置相差顯微鏡、Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀、AC2-6S1型Ⅱ級生物安全柜、CCL-170A型CO2培養(yǎng)箱、3K15型臺式冷凍高速離心機(jī)、DW-86L486超低溫冰箱。Mouse IL-2、TNF-α ELISA試劑盒均購自美國R&D公司，MTT購自Sigma公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對人腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制作用 采用改良MTT法[3]檢測受試物對人腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制活性。取對數(shù)生長期細(xì)胞90 μL/孔接種于96孔板，濃度分別為5×104個/mL(貼壁細(xì)胞)和1×105個/mL(懸浮細(xì)胞)，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)24 h后(懸浮細(xì)胞接種后即加藥)加入不同濃度的受試物溶液10 μL(終濃度為100、50、25、12.5、6.25 μg/mL)，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，并設(shè)溶媒對照孔及無細(xì)胞調(diào)零孔。受試物與細(xì)胞共孵育48～72 h 后加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入三聯(lián)液(10% SDS-5%異丁醇-0.01 mol/L HCl)50 μL/孔，于CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，用酶標(biāo)儀于570 nm處測定吸光度。按下列公式計算腫瘤生長抑制率，并采用LOGIT法計算半數(shù)抑制濃度IC50值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2 對小鼠移植瘤的生長抑制作用和免疫調(diào)節(jié)作用 參考文獻(xiàn)[4]方法，將處于對數(shù)生長期的小鼠肝癌H22腫瘤細(xì)胞計數(shù)后，用無菌生理鹽水調(diào)細(xì)胞濃度為1×107/mL濃度，接種于小鼠右側(cè)腋部皮下，0.2 mL/只。取接種24h后的小鼠50只，隨機(jī)分為溶媒對照組(純水)、環(huán)磷酰胺組(20 mg/kg)和虎掌草醇提物0.5、1.0、2.0 g/kg劑量組，每組10只。其中環(huán)磷酰胺以0.1 mL/10 g腹腔注射給藥，其余各組均以0.2 mL/10 g灌胃給藥，每天1次，連續(xù)10d。第11d稱量小鼠體重，摘眼球取血，3000 r/min離心10 min，取上清并參照ELISA試劑盒操作步驟，檢測小鼠血清 IL-2、TNF-α；頸椎脫臼處死，剖取腫瘤稱重，按下列公式計算抑瘤率；剖取動物胸腺和脾臟稱重，按下列公式計算臟器指數(shù)[5]

2.3 小鼠急性毒性試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[5]方法，將70只KM小鼠隨機(jī)分為7組，即溶媒對照組(純水)和虎掌草醇提物11.20，8.96，7.17，5.74，4.59和3.67 g/kg劑量組，每組10只，雌雄各半。禁食不禁水約6 h后，各劑量組均以40 mL/kg灌胃給予虎掌草醇提物不同濃度溶液1次，陰性對照組同法給予純水1次。給藥當(dāng)天連續(xù)觀察4 h動物出現(xiàn)的各種毒性反應(yīng)、癥狀及死亡情況，以后每天觀察1次，連續(xù)14 d；于給藥第3、7、14 d稱量體重；觀察結(jié)束后處死動物，大體解剖觀察各組動物臟器、器官的體積、顏色、質(zhì)地等有無明顯異常。采用Bliss法計算虎掌草醇提物小鼠急性毒性的LD50及95%可信限。

3 結(jié)果

3.1 對人腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制作用 結(jié)果顯示：虎掌草醇提物對人HepG-2、K562、A549和PC-3細(xì)胞株具有明顯的增殖抑制活性，且結(jié)果呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。其IC50值分別為(6.56±1.23)μg/mL、(4.13±0.96)μg/mL、(6.46±1.77)μg/mL、(7.30±1.56)μg/mL，結(jié)果見圖1。

圖1 虎掌草醇提物對人腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制活性

3.2 對小鼠荷瘤小鼠體重及腫瘤生長的影響 與溶媒對照組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠體重明顯下降(P<0.01)，虎掌草醇提物各劑量組對小鼠體重均無明顯影響(P>0.05)。與溶媒對照組比較，虎掌草醇提物1.0 g/kg劑量組小鼠的平均瘤重明顯減輕(P<0.05)，虎掌草醇提物2.0 g/kg劑量組小鼠的平均瘤重明顯減輕(P<0.01)，結(jié)果見表1。

表1 虎掌草醇提物對小鼠移植性肝癌H22生長的影響±s)

注：與溶媒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.3 對荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響 與溶媒對照組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯下降(P<0.01)?；⒄撇荽继嵛?.0 g/kg劑量可明顯提升小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)(P<0.05)，結(jié)果見表2。

表2 虎掌草醇提物對小鼠免疫器官指數(shù)的影響±s)

注：與溶媒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.4 對小鼠血清IL-2、TNF-α水平的影響 與溶媒對照組比較，虎掌草醇提物1.0、2.0 g/kg劑量組小鼠血清TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與溶媒對照組比較，虎掌草醇提物2.0 g/kg劑量組小鼠血清IL-2水平顯著升高(P<0.05)，結(jié)果見表3。

表3 虎掌草醇提物對小鼠血清TNF-α、IL-2水平影響

注：與溶媒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.5 急性毒性試驗(yàn) 虎掌草醇提物小鼠灌胃給藥LD50為6.218 g/kg，95%可信限為5.104 g/kg～7.526 g/kg。受試動物的主要毒性反應(yīng)為不進(jìn)食、俯臥、運(yùn)動減少、腹瀉、豎毛、紫紺、運(yùn)動失調(diào)、呼吸困難、抽搐等癥狀。實(shí)驗(yàn)期間，于給藥后第3、7、14天對各劑量組存活動物稱重，各組小鼠體重均持續(xù)增長，與溶媒對照組比較，無顯著性差異(P>0.05)。據(jù)毒性反應(yīng)結(jié)果推測其毒性可能涉及的組織、器官、系統(tǒng)為中樞神經(jīng)、神經(jīng)肌肉、自主神經(jīng)和肺臟功能損傷，結(jié)果見表4和表5。

表4 虎掌草醇提物小鼠急性毒性試驗(yàn)急性動物體重(♀/♂)

注：與溶媒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

表5 虎掌草醇提物小鼠灌胃急性毒性試驗(yàn)動物的毒性反應(yīng)(♀/♂)

4 討論

虎掌草是云南民間常用藥，可用于治療喉蛾、痄腮、瘰疬結(jié)核、癰疽腫毒、瘧疾、風(fēng)濕疼痛、胃痛、跌打損傷等疾病，在民間可用于癌癥的治療。為了進(jìn)一步開發(fā)利用本植物，我們對其體內(nèi)、外抗腫瘤活性、免疫調(diào)節(jié)作用和急性毒性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，虎掌草醇提物可明顯抑制4種人腫瘤細(xì)胞株的增殖和小鼠肝癌H22腫瘤的生長、明顯提升小鼠胸腺和脾臟指數(shù)，并能通過提升小鼠血清中TNF-α和IL-2水平，對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接或間接殺傷作用。本實(shí)驗(yàn)研究為虎掌草的產(chǎn)品開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海：科學(xué)技術(shù)出版社，1999.3·164～3·166.

[2]云南省衛(wèi)生局革命委員會.云南中草藥[M].昆明：人民出版社，1971.470～471.

[3]甄永蘇.抗腫瘤藥物研究與開發(fā).第1版[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：721～729.

[4]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理試驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1766.

[5]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：108-109.

Study on the Anti-tumor Activity and Immunomodulatory Effect of Alcohol Extraction ofBrookAnemone

WU De-song, LIU Jia, WEI Di, ZHAO Dao-qiang, ZHOU Ming-tao, FENG Li-ping

(YunnanInstituteofMateriaMedica;InnovationandDevelopmentCenter,YunnanBaiyaoGroup;KeyLaboratory,YunnanNewMedicineDevelopmentBusinessofTraditionalChineseMedicineandEthno-Medicine,Kunming650111,Yunnan)

Objective: To observe the anti-tumor activity of alcohol extraction ofBrookAnemoneand its effect on the immunity of tumor-bearing mice. Methods: MTT was modified to detect alcohol extract ofBrookAnemoneon the proliferation inhibitory activity of Hep G-2, K562, A549 and PC-3 cell line of people. Tumor transplanted mice model was used to study the influence of the alcohol extract ofBrookAnemoneon the growth of liver cancer H22. Immune organ weight was used to detect immune organ index of the tumor-bearing mice; ELISA method to detect their serum IL-2 and TNF-a levels; the acute toxicity test preliminarily to evaluate the safety ofBrookAnemone. Results: The alcohol extract ofBrookAnemonehad a significant growth inhibitory activity in vitro for human tumor cell lines and its IC50values were less than 10 μg/mL. The 1.0, 2.0 g/kg dose of alcohol extract significantly inhibited H22liver cancer growth of the mice, but no obvious effect on body weight of the mice.BrookAnemonecan significantly raise the thymus index and spleen index and the serum TNF-α and IL-2 levels. When the mica were given intragastric infusion of alcohol extract LD50 6.218 g/kg, 95% confidence interval was 5.104 g/kg ～ 7.526 g/kg. Its tissue toxicity may be involved in the central nervous, neuromuscular and autonomic nerve injury and lung function impairment of organs, central nervous system and nerves muscle. Conclusion: The ethanol extract ofBrookAnemonehas obvious anti-tumor activity in vivo and in vitro and its activity may be related to the improvement of animal immunity and the serum IL-2 and TNF-α level of the mice.

BrookAnemone, anti-tumor, immunomodulatory

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項(xiàng)目青年基金：兩種天然藥物的抗腫瘤、心血管活性篩選研究(NO：2012FD074)

吳德松，男，河南洛陽人，碩士，工程師，主要從事天然藥物篩選研究與開發(fā)工作，E-mail：wudesong14@163.com。

△通信作者：馮莉萍，E-mail：kongzhongdefeiyu@126.com。

R285.6

A

1007-2349(2015)07-0058-03

2015-04-13)