曾 宇，張三印

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

當(dāng)歸補血湯對異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化的影響*

曾 宇，張三印△

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

目的 探討當(dāng)歸補血湯對異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化的影響。方法 50只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、當(dāng)歸補血湯大劑量組、當(dāng)歸補血湯小劑量組、陽性對照組。除空白對照組，其它四組大鼠給予背部皮下注射異丙腎上腺素5 mgkg-1d-1，連續(xù)10天。陽性對照組給予卡托普利50 mg/kg-1灌胃，當(dāng)歸補血湯大和小劑量組給予當(dāng)歸補血湯各7.56 g/kg-1和3.78 g/kg-1灌胃，空白對照組和模型對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，每天一次。連續(xù)給藥28d后，給予血流動力學(xué)檢測，計算心臟指數(shù)，病理檢測，Hpy含量檢測。結(jié)果 與空白對照組比較，模型對照組的心臟指數(shù)升高(P<0.05)，左心功能降低，Hpy含量增加(P<0.01)。與模型對照組比較，當(dāng)歸補血湯大劑量、小劑量組大鼠心肌纖維化病變程度降低，心臟組織的Hpy含量降低，左心功能有改善。結(jié)論 當(dāng)歸補血湯能抑制心肌間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白，減輕心肌纖維化，改善左心功能。

心肌纖維化；當(dāng)歸補血湯；羥脯氨酸

心肌纖維化(Myocardial Fibrosis)是由多種心血管疾病發(fā)展到一定程度時可引起心肌纖維，并逐漸發(fā)展為慢性缺血性心臟??；同時在心肌纖維化是心室重構(gòu)的關(guān)鍵原因，出現(xiàn)舒張功能障礙[1-2]。因此加強對心肌纖維化的研究和防治具有重要的臨床意義。我國的中醫(yī)藥對心肌纖維化有獨特的療效[3-4]，且副作用少。當(dāng)歸補血湯是金典的補氣益氣方，由當(dāng)歸和黃芪兩味中藥組成，其治療心血管疾病的報道屢見不鮮，療效顯著。本研究觀察當(dāng)歸補血湯對異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化的影響。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠 50只，雄性，體重200-220 g，SPF級，購自簡陽市簡城比爾動物養(yǎng)殖場，許可證號SCXK(川)2013-24。

1.2 藥品與試劑 異丙腎上腺素(上海伊卡生物技術(shù)有限公司)，卡托普利(汕頭金石制藥廠)。當(dāng)歸(產(chǎn)于甘肅)、黃芪(產(chǎn)于內(nèi)蒙古)由成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室國錦琳副教授鑒定。當(dāng)歸180 g，黃芪900 g，水煎，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮為每毫升含1 g藥。Elisa試劑盒(Abcam公司)。水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠)。無水乙醇(成都科龍化工試劑廠)。二甲苯(成都科龍化工試劑廠)。甲苯胺藍(lán)(上海如吉生物科技發(fā)展公司)。蘇木素(北京百靈威科技有限公司)。麗春紅(成都科龍化工試劑廠)。

1.3 儀器 Powerlab生理記錄系統(tǒng)(埃德儀器國際貿(mào)易有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，電子秤(德國Sartorius公司)，酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司)，電子恒溫浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，移液槍(大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)，槍頭(美國Axygen公司生產(chǎn))，EP管(美國Axygen公司生產(chǎn))

2 方法

2.1 心肌纖維化動物模型的制備 大鼠背部皮下注射異丙腎上腺素5 mg/kg-1·d-1，連續(xù)10d。自由進(jìn)食進(jìn)水，空白對照組注射同體積的生理鹽水。

2.2 分組與給藥 大鼠隨機分為5組，空白對照組，模型對照組，陽性對照組，DBT大劑量組、DBT小劑量組。每組10只。灌胃給藥28 d，每天1次，陽性對照組給予卡托普利50 mg/kg-1，DBT大和DBT小劑量組分別給予當(dāng)歸補血湯7.56 g/kg-1和3.78 g/kg-1灌胃，空白對照組和模型對照組給予等體積的生理鹽水。

2.3 心功能檢測 灌胃28天后，稱重，用10%水合氯醛0.3 mL/kg-1腹腔注射麻醉大鼠。固定。剪去頸部毛，頸部做一“L”型切口，分離筋膜和肌肉，找到頸動脈鞘，分離出頸總動脈。結(jié)扎頸總動脈遠(yuǎn)心端，動脈夾夾住近心端，在結(jié)扎處附近做以小切口，插入Millar導(dǎo)管，固定導(dǎo)管，松開動脈夾，繼續(xù)推入導(dǎo)管，觀察電腦屏幕血壓的變化，當(dāng)有落空感和血壓最低接近0 mmHg，出現(xiàn)心室波時，則導(dǎo)管進(jìn)入左心室[5]。選擇一段好的波形進(jìn)行軟件分析。

2.4 標(biāo)本采集與制備 心功能檢測完后，剪開胸腔，取出心臟，蒸餾水沖洗，濾紙吸干水分，分離左心室，分別稱出全心重量和左心室重量。在近心尖5 mm處取左心室組織，固定，制備病理切片。剩余左心室組織保存于-80℃冰箱中，用于測量心肌Hyp含量。

2.5 組織病理學(xué)與心肌纖維化檢測 大鼠心肌組織用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片(5 um)，分別進(jìn)行HE染色和MASSON膠原特異染色。對切片進(jìn)行圖像采集，每張切片于100倍下觀察組織，再根據(jù)表達(dá)情況分別選取1-3個區(qū)域400倍采集圖像。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定采集全部圖像的平均光密度，取平均值。

2.6 心肌組織Hyp含量測定 采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)測定大鼠心肌組織羥脯氨酸(Hyp)的水平。向預(yù)先包被了大鼠羥脯氨酸單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入羥脯氨酸，溫育；溫育后加入生物標(biāo)記的抗Hyp抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，去除為結(jié)合的酶，加入顯色劑。顏色的深淺與樣品中大鼠羥脯氨酸的濃度呈正相關(guān)。

3 結(jié)果

3.1 對心肌纖維化大鼠心臟指數(shù)的影響 與空白對照組比較，模型對照組的心臟指數(shù)升高(P<0.05)，表明異丙腎上腺素能促進(jìn)心肌膠原纖維增生，是心臟質(zhì)量增加。與模型對照組比較，DBT大劑量組、DBT小劑量組和陽性對照組的心臟指數(shù)均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。空白對照組、DBT大劑量組、DBT小劑量組、陽性對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 當(dāng)歸補血湯對心肌纖維化大鼠心臟指數(shù)的影響±s，n=8)

注：與模型對照組比較，#P<0.05。

3.2 對心肌纖維化大鼠心功能的影響 與空白對照組比較，模型對照組SW、CO、Pes、EF、dP/dt max、-dP/dt min、-dV/dt min降低(P<0.05)，表明異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化大鼠左心功能下降。與模型對照組比較：DBT大劑量組SW、EF、dV/dt max、-dV/dt min升高(P<0.05)；DBT小劑量組EF、-dV/dt min升高(P<0.05)；陽性對照組EF升高(P<0.05)。以上數(shù)據(jù)表明DBT大劑量和DBT小劑量有改善大鼠左心功能的作用。見表2。

表2 當(dāng)歸補血湯對心肌纖維化大鼠心功能的影響±s，n=8)

注：#P<0.05，與空白對照組比較；*P<0.05，與模型對照組比較。1mmHg≈0.133kPa。SW：每搏功，CO：每分心輸出量，Ped：舒張壓，Pes：收縮壓，EF：射血分?jǐn)?shù)，dP/dt max：壓力上升速率最大值，-dP/dt min：壓力下降速率最大值，dV/dt max：容積上升速率最大值，-dV/dt min：容積下降速率最大值。

3.3 當(dāng)歸補血湯對心肌組織病理變化的影響 空白對照組心肌纖維排列正常。模型對照組的心肌纖維排列紊亂，可見波浪樣變，心肌間隙增大，部分心肌細(xì)胞變性和溶解壞死，肌間纖維結(jié)締組織大片增生，毛細(xì)血管擴(kuò)張增生，其間可見大量單核、淋巴細(xì)胞的浸潤和成纖維細(xì)胞的增生。與模型對照組比較，DBT大劑量和DBT小劑量及陽性對照組的心肌纖維化病灶局限，病變明顯較輕，表明當(dāng)歸補血湯可以減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化。見圖1、2。

圖1 當(dāng)歸補血湯對心肌組織病理變化的影響(HE染色，×400)

圖2 當(dāng)歸補血湯對心肌組織病理變化的影響(MASSON染色，×400)

3.4 對心肌纖維化大鼠心臟組織Hpy的影響 模型對照組大鼠心肌組織中Hpy含量顯著高于空白對照組(P<0.01)；DBT大劑量組與陽性對照組心肌組織中Hpy含量明顯低于模型對照組；DBT小劑量組大鼠心肌組織中Hpy含量降低不明顯(P>0.05)。見表3。

表3 當(dāng)歸補血湯對各組大鼠心臟組織Hpy的影響±s，n=8)

注：#P<0.05、##P<0.01，與空白對照組比較；*P<0.05、**P<0.01，與模型對照組比較。

4 討論

當(dāng)歸補血湯是金元時代李東恒所創(chuàng)的益氣補血方劑，由黃芪和當(dāng)歸兩味藥以5∶1比例組成，具有促進(jìn)造血、調(diào)節(jié)免疫功能、保護(hù)心腦血管等作用[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)黃芪、當(dāng)歸有抑制膠原增生，減輕心肌纖維化的作用[8-10]。因此本實驗采用金典方當(dāng)歸補血湯對心肌纖維化大鼠進(jìn)行研究，推廣當(dāng)歸補血湯的應(yīng)用。

研究表明[11]，卡托普利可以抑制大鼠心肌纖維化，故本實驗以卡托普利作為陽性對照藥物。

異丙腎上腺素屬于兒茶酚胺類物質(zhì)，連續(xù)皮下注射造成多發(fā)性灶狀心肌壞死導(dǎo)致心肌纖維化[12-13]。本實驗中模型對照組大鼠心臟指數(shù)、心肌Hpy含量明顯高于空白對照組，病理切片可見大量膠原纖維增生，左心功能明顯下降；表明大鼠心肌纖維化模型建立成功。DBT大劑量組大鼠心臟組織的Hpy含量明顯低于模型對照組；DBT小劑量也有降低，但無統(tǒng)計意義。從生化檢驗和形態(tài)學(xué)分析表明，大劑當(dāng)歸補血湯能抑制心肌間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白，減輕心肌纖維化，改善了左心功能。有研究表明異丙腎上腺素引起心肌纖維化不僅與自身的β受體激動劑的特點有關(guān)，還與影響心肌纖維化形成的細(xì)胞因子有關(guān)[14-15]，因此當(dāng)歸補血湯改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化的分子機制，還需進(jìn)一步研究。

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Influence ofDangguiBuxueDecoctionon Myocardial Fibrosis of Isoproterenol Induced Rats

ZENG Yu, ZHANG San-yin

(ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu611137,Sichuan)

Objective: To study the influence ofDangguiBuxueDecoction(DBD) on myocardial fibrosis of isoproterenol-induced rats. Methods: 50 SD rats were randomly divided into a normal control group, a model group, a DBD high-dose group, a DBD low-dose group and a positive control group. Except the normal control group, the rats of other four groups were given subcutaneous injection of isoproterenol 5 mg/kg-1d-1for 10 days. The positive control group was given intragastric infusion of captopril 50 mg/kg-1. The DBD high-dose and low-dose groups were given intragastric infusion of DBD 7.56 g/kg-1and 3.78 g/kg-1respectively. The normal control group and the model group were given intragastric infusion of equivoluminal?normal saline, once a day. After 28-day successive administration, hemodynamics detection, cardiac index calculation, pathological examination and Hpy content detection were made. Results: When compared with the normal control group, the cardiac index of the model group increased (P<0.05), their left ventricular function decreased and Hpy content increased (P<0.01). When compared with the model group, the DBD high-dose and low-dose groups reduced the severity of myocardial fibrosis lesion of the rats and their Hpy content of heart tissue decreased and their left ventricular function improved. Conclusion: DBD can inhibit myocardial interstitial cells to produce collagen, reduce myocardial fibrosis and improve left ventricular function.

myocardial fibrosis,DangguiBuxueDecoction, hydroxyproline

國家自然科學(xué)基金項目(81001497)，成都中醫(yī)藥大學(xué)校基金項目(030018060)。

曾宇(1986-)，女，漢族，四川，助教，碩士，研究方向：中醫(yī)藥及血管生成，E-mail：595279347@qq.com。

△通信作者：張三印(1976-)，男，漢族，陜西，教授，博士，研究方向：中醫(yī)藥及血管生成，E-mail：tcmzsy@126.com。

R541

A

1007-2349(2015)07-0017-05

2015-05-17)