馬寅芙，李首慶，劉 磊，孫牧男，譚 巖

（吉林省人民醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130021）

慢性丙型肝炎患者外周血DNT細(xì)胞與HCV－RNA病毒載量關(guān)系的研究

馬寅芙，李首慶，劉 磊，孫牧男，譚 巖＊

（吉林省人民醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130021）

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染機(jī)體后所引起的傳染性疾病。大多數(shù)的丙型肝炎患者感染后轉(zhuǎn)為慢性，病毒在體內(nèi)持續(xù)存在，慢性丙型肝炎是引起肝硬化和肝癌的重要原因之一。CD3＋CD4－CD8－T細(xì)胞（雙陰性T細(xì)胞，DNT）是一種新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群，研究發(fā)現(xiàn)其在移植排斥、自身免疫性疾病、腫瘤免疫、感染性疾病、過敏性疾病以及移植物抗宿主病等疾病中發(fā)揮重要作用［1］，成為近年來免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。本文利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢性丙型肝炎患者外周血中CD3，CD4，CD8及DNT細(xì)胞的表達(dá)，PCR方法檢測(cè)HCV－RNA病毒載量，研究慢性丙型肝炎患者外周血中DNT細(xì)胞的表達(dá)與HCV－RNA病毒載量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取我院2014年8月至2014年12月門診及住院慢性丙型肝炎患者78例，男性33例，女性45例，年齡18－70歲。病例診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2004年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)制定的《丙型肝炎防治指南》［2］。排除甲、乙型等肝炎其他病毒性疾病、自身免疫性肝病、藥物及酒精性肝炎等。健康對(duì)照組25例，男12例，女13例，年齡28－66歲，為我院體檢中心體檢結(jié)果正常的健康人群。

1.2 標(biāo)本采集和處理 患者空腹采集靜脈血3ml入生化管，離心取血清進(jìn)行PCR檢測(cè)；1ml入EDTA抗凝管用于流式檢測(cè)。

1.3 試劑和儀器 流式細(xì)胞儀美國(guó)Beckman Coulter Epics XL；熒光定量PCR儀美國(guó)ABI 7500。OptiLyse C溶血素購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；熒光抗體FITC－CD4／PE－CD8／PE－CY5－CD3購(gòu)自美國(guó)BD；HCV－RNA試劑盒購(gòu)自上海科華有限公司。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)HCV－RNA定量 參考上?？迫A《丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR－熒光探針法）》說明書操作。將檢測(cè)結(jié)果分為兩組：HCV－RNA＜1＋E003IU／ml，HCV－RNA≥1＋E003IU／ml。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群及DNT表達(dá)量管中加入100μl全血，加FITC－CD4／PE－CD8／PECY5－CD3抗體20μl，混勻室溫避光孵育15分鐘；加入1ml溶血素，混勻避光10分鐘；加入1ml生理鹽水，混勻1 500r／min離心5分鐘；棄上清，加入500μl生理鹽水混勻上機(jī)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x—±s）表示，樣本均數(shù)間差異比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCV－RNA病毒含量不同的慢性丙型肝炎患者T細(xì)胞亞群表達(dá)

慢性丙型肝炎患者無論病毒含量高低CD4＋T淋巴細(xì)胞比例及CD4＋／CD8＋比值均低于健康對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著病毒含量的升高，CD4＋／CD8＋比值也在持續(xù)降低（P＜0.05）（如表1）。

2.2 HCV－RNA病毒含量不同的慢性丙型肝炎患者DNT細(xì)胞表達(dá)

慢性丙型肝炎患者無論病毒含量的高低其外周血DNT細(xì)胞的表達(dá)量均高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著丙肝病毒含量的升高，HCV－RNA≥1＋E003IU／ml的患者外周血中DNT細(xì)胞的表達(dá)量高于HCV－RNA＜1＋E003 IU／ml患者的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（如表2）。

表1 HCV－RNA病毒含量不同的慢性丙型肝炎患者T細(xì)胞亞群表達(dá)

表2 HCV－RNA病毒含量不同的慢性丙型肝炎患者DNT細(xì)胞表達(dá)

3 討論

丙型肝炎呈世界性分布，約80%的丙型肝炎患者為慢性化發(fā)展，約30%的患者發(fā)展為肝硬化、肝癌［3］。HCV－RNA是病毒復(fù)制的指標(biāo)，臨床通過HCV－RNA病毒含量的變化來判斷病情，并在治療藥物的選擇及判斷療效上也具有重要意義［4］。目前HCV的致病機(jī)制正在研究中，HCV感染后，體內(nèi)T淋巴細(xì)胞缺失及功能紊亂，導(dǎo)致病毒持續(xù)感染，使丙型肝炎慢性化。有研究認(rèn)為［5］，機(jī)體對(duì)HCV免疫應(yīng)答低下是導(dǎo)致HCV感染慢性化的主要原因之一。本文研究結(jié)果顯示慢性丙型肝炎患者CD4＋T細(xì)胞及CD4＋／CD8＋比值低于健康對(duì)照組，T淋巴細(xì)胞亞群比例異常，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，免疫處于抑制狀態(tài)，清除病毒能力下降，從而導(dǎo)致HCV病毒持續(xù)感染。

DNT細(xì)胞最早發(fā)現(xiàn)于成年小鼠的脾臟及人的外周血中，它的含量很低，僅占小鼠和人的外周血淋巴細(xì)胞的1%－3%［6，7］。對(duì)于DNT細(xì)胞的來源和成熟途徑尚不完全清楚。有研究發(fā)現(xiàn)DNT可能來源于胸腺pre－TCR DN細(xì)胞（DN3）［8］、CD8＋T細(xì)胞［9，10］、CD4＋T［11］、胸腺外器官［12，13］等。DNT細(xì)胞是一種特殊的調(diào)節(jié)T細(xì)胞，其在體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制縱說紛紜。DNT細(xì)胞能下調(diào)高度活化的效應(yīng)CD4＋T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞的擴(kuò)增和細(xì)胞因子的產(chǎn)生［14］，抑制B細(xì)胞、NK細(xì)胞的活化［15，16］。

病毒特異性CD8＋T淋巴細(xì)胞應(yīng)答低下會(huì)導(dǎo)致循環(huán)病毒量增加，使病毒難以從機(jī)體內(nèi)被清除，而導(dǎo)致肝炎的慢性化［17］。孫穎［18］等研究發(fā)現(xiàn)DNT細(xì)胞能夠通過Fss／Fasl途徑殺傷病毒特異性CD8＋T細(xì)胞。Zhang［19］等研究發(fā)現(xiàn)DNT細(xì)胞可殺傷B細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞。因此在慢性丙型肝炎患者體內(nèi)，增高的DNT細(xì)胞抑制了CD4＋T細(xì)胞及特異性抗病毒CD8＋T細(xì)胞功能，機(jī)體清除HCV病毒能力下降，使病毒長(zhǎng)期存在造成慢性感染。本文研究結(jié)果慢性丙型肝炎患者CD4＋T細(xì)胞比例下降，而CD8＋T細(xì)胞并未降低，可能是非抗病毒CD8＋T細(xì)胞增加，而特異性抗病毒CD8＋T細(xì)胞減少。

本文研究結(jié)果顯示慢性丙肝患者T細(xì)胞DNT細(xì)胞表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組，并且隨著HCVRNA載量的增加，慢性丙型肝炎患者外周血中DNT細(xì)胞表達(dá)與HCV－RNA病毒載量呈正相關(guān)。DNT細(xì)胞高表達(dá)使機(jī)體免疫應(yīng)答能力減弱，使機(jī)體抗病毒能力降低，丙型肝炎病毒在體內(nèi)持續(xù)復(fù)制呈現(xiàn)慢性發(fā)展。DNT細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)對(duì)慢性丙型肝炎患者免疫功能狀態(tài)判斷、病情評(píng)估、治療效果中具有重要意義。

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2015－03－09）

1007－4287（2015）10－1754－03

中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才及團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目，吉林省腫瘤生物治療創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（20140519018JH）；吉林省科技廳青年科研基金項(xiàng)目（20140520037JH）

＊通訊作者