呂夢(mèng)圓，石佳仙，夏祥，林建國(guó)，蔡俊，胡瑛

(湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部生物工程學(xué)院，發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢，430068)

幾丁質(zhì)(chitin)是自然界僅次于纖維素的第二大生物質(zhì)資源［1］，每年生物合成量約為100多億噸［2］，其中蝦、蟹等甲殼類的甲殼富含1/4～1/3的幾丁質(zhì)。殼聚糖是幾丁質(zhì)的N-脫乙?；难苌铮彩亲匀唤缥ㄒ淮罅看嬖诘奶烊粔A性多糖［3］。幾丁質(zhì)和殼聚糖是由β(1→4)連接的2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖(GlcNAc)和2-氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖(GlcN)二元線性共聚物所組成的，脫乙酰化和乙?；g的平衡程度用脫乙酰度(DD)來(lái)表征。幾丁質(zhì)由于分子內(nèi)和分子間強(qiáng)烈的氫鍵作用而不溶于大多數(shù)溶劑，從而大大限制其應(yīng)用。而甲殼寡糖溶解性增加，且具有提高免疫力，抑制癌腫細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)肝脾抗體形成，促進(jìn)鈣及礦物質(zhì)的吸收，增加雙歧桿菌、乳酸菌等人體有益菌群，降血脂，降血壓，降血糖，調(diào)節(jié)膽固醇，減肥，預(yù)防成人疾病等功能，可用于醫(yī)藥、功能性食品等領(lǐng)域［4］。所以，酶法降解幾丁質(zhì)來(lái)制備甲殼寡糖是幾丁質(zhì)研究和開(kāi)發(fā)利用的熱點(diǎn)之一。

幾丁質(zhì)酶(Chitinase，Ec.3.2.1.14)是一類能特異性和選擇性催化降解幾丁質(zhì)β-1，4-糖苷鍵的水解酶［5］。且?guī)锥≠|(zhì)酶還具有多種潛在用途，如抗真菌，防治病蟲(chóng)害，制備功能性甲殼寡糖，處理幾丁質(zhì)廢物，制備真菌原生質(zhì)體等［6-7］。幾丁質(zhì)酶根據(jù)其氨基酸序列主要分為18、19和20三個(gè)家族［8-9］。18族水解主要采用雙替換構(gòu)型保持機(jī)制，即底物的N-乙酰基團(tuán)的鄰助作用和底物發(fā)生變形成船形構(gòu)型協(xié)助催化。根據(jù)幾丁質(zhì)酶切割底物的位點(diǎn)不同，又可分為β-N-乙酰氨基葡萄糖、外切酶和內(nèi)切酶。幾丁質(zhì)外切酶能從幾丁質(zhì)的非還原端以二糖為單位進(jìn)行切割，產(chǎn)物為甲殼二糖。N-乙酰氨基葡萄糖酶能把二糖酶切為單糖，也就是乙酰氨基葡萄糖。幾丁質(zhì)內(nèi)切酶可以隨意酶切幾丁質(zhì)之間的糖苷鍵來(lái)得到甲殼寡糖［10］。產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物種類很多，包括細(xì)菌、放線菌和真菌等。Vaaje-Kolstad從Lactococcus lactis ssp.lactis IL1403中得到的幾丁質(zhì)水解體系，含有幾丁質(zhì)酶18族和幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白33族，可水解α-和β-幾丁質(zhì)，但約85% α-幾丁質(zhì)未被水解［11］。以4-甲基傘形酮人工合成的各種熒光底物由于反應(yīng)靈敏而常常作為底物檢測(cè)酶活和研究酶學(xué)性質(zhì)，但天然底物和熒光底物之間存在較大差異。天然幾丁質(zhì)結(jié)晶度高而溶解性差，但水溶性殼聚糖可溶于水，DD和幾丁質(zhì)較接近。幾丁質(zhì)酶是一類差異較大的水解酶類，已有不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶的分離純化及性質(zhì)研究的報(bào)道［4-9］。

本文將來(lái)源于Lactococus lactis ssp.lactis IL1403菌株的幾丁質(zhì)酶BL21(DE3)基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21 DE3中進(jìn)行大量表達(dá)，純化后得到幾丁質(zhì)酶，采用SDS-PAGE分析其分子量，采用還原糖法和熒光法來(lái)研究幾丁質(zhì)酶對(duì)不同底物的酶學(xué)性質(zhì)，研究了pH、溫度、不同金屬離子和表面活性劑對(duì)酶活的影響，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測(cè)定米氏方程，并采用薄層層析(TLC)和高效液相色譜(HPLC)對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析比較，為幾丁質(zhì)酶降解不同底物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

考馬氏亮藍(lán)G-250、N-乙酰氨基葡萄糖和4MU-(GlcNAc)3購(gòu)于 Sigma公司;系列幾丁寡糖(Glc-NAc)2、(GlcNAc)3、(GlcNAc)4、(GlcNAc)5和(Glc-NAc)6，青島博智匯力生物科技有限公司;幾丁質(zhì)，上海源葉生物有限公司;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，Takara公司產(chǎn)品;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。E.coli BL21(DE3)，Invitrogen公司;Ni-NTA 柱(3 cm ×5 cm)，上海生工生物工程有限公司;TLC玻璃硅膠板，青島海洋化工;JY92-11超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;蛋白電泳儀，北京六一儀器;LS-45/55熒光分光光度計(jì)，美國(guó)Perkin Elme公司;LC-20AD，日本SHIMADZU公司。

1.2 不同底物的制備

1.2.1 膠體幾丁質(zhì)的制備

按照參考文獻(xiàn)［12］制備。

1.2.2 N-乙?；瘹ぞ厶堑闹苽?/p>

按照文獻(xiàn)［13］進(jìn)行N-乙?；磻?yīng)，采用酸堿滴定法測(cè)定合成產(chǎn)物的脫乙酰度，水溶性殼聚糖的DD為50%左右;N-乙酰化殼聚糖的DD為70%左右。

1.3 克隆幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)純化

重組質(zhì)粒pETM11-LlChi18A由加拿大Alberta大學(xué)提供，并采用化學(xué)法轉(zhuǎn)化到表達(dá)載體E.coli BL21(DE3)中［11］。通過(guò)優(yōu)化產(chǎn)酶條件后，接種隔夜培養(yǎng)的E.coli到含有50 μg/mL卡那霉素的150 mL Luria-Bertani培養(yǎng)基，在37℃和250 r/min下培養(yǎng)至OD600達(dá)到 0.6 時(shí)，添加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)最終濃度為0.05 mmol/L，在20℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，4℃離心10 min(8 000r/min)收集菌體，用PBS緩沖溶液(pH7.5)洗滌菌體。以10倍體積濃縮加入PBS，進(jìn)行超聲波破碎。功率40 W，超聲4 s，間歇6 s，超聲時(shí)間15 min。破碎后的菌液于4℃離心10 min(10 000 r/min)，取上清液采用Ni-NTA進(jìn)行親和層析純化。用流動(dòng)相緩沖液平衡柱子，收集甲殼酶的峰的流出液，用10 kDa超濾膜去除收集液中的咪唑并濃縮酶液，得到純化后的幾丁質(zhì)酶液。

1.4 蛋白質(zhì)性質(zhì)

1.4.1 SDS-PAGE

采用垂直板狀電泳，SDS-PAGE按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行［14］。

1.4.2 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量［15］

以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.753 7X-0.038 12，R2=0.993;X為蛋白質(zhì)濃度，Y為吸光度)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和A595吸光度值換算幾丁質(zhì)酶液的蛋白質(zhì)含量。

1.5 幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)

1.5.1 酶的底物特異性

分別以膠體幾丁質(zhì)、N-乙?；瘹ぞ厶?、水溶性殼聚糖和4MU-(GlcNAc)3為底物，比較幾丁質(zhì)酶的底物特異性。

1.5.1.1 膠體幾丁質(zhì)、N-乙?；瘹ぞ厶?、水溶性殼聚糖為底物

底物濃度分別為 0.1%，參照 Nawani法［16］，取一定量幾丁質(zhì)酶(酶底比為0.3%)于50℃下水浴反應(yīng)10 min，采用改良 Schales法［17］測(cè)定還原糖。1個(gè)酶活力單位是指在50℃下，每分鐘釋放1 μmol還原糖的酶量，而比酶活為1mg幾丁質(zhì)酶所具有的酶活力單位［18］。3次平行的結(jié)果取平均值。

1.5.1.2 熒光底物

以熒光物質(zhì)4-甲基傘形酮(4-MU)為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用熒光分光光度計(jì)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.639 8X+2.448 4(R2=0.991;X 為4-MU 濃度，Y 為熒光值)。以不同濃度的4-MU-(GlcNAc)3(Sigma)為底物，反應(yīng)液還包含2.0 nmol/L幾丁質(zhì)酶，2.0 mg/mL牛血清白蛋白和200 μL 50 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液。37℃下反應(yīng)不同時(shí)間，取50 μL樣液，加入1.95 mL Na2CO3(0.2 mol/L)停止反應(yīng)，采用熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)380 nm、發(fā)射波長(zhǎng)460 nm)測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活和比酶活，4次平行的結(jié)果取平均值。1個(gè)酶活力單位是指在37℃下，1 min釋放1 μmol熒光物質(zhì)的酶量。比酶活為1 mg幾丁質(zhì)酶所具有的酶活力單位。

1.5.2 動(dòng)力學(xué)方程

將酶液與不同底物的膠體幾丁質(zhì)和水溶性殼聚糖反應(yīng)后測(cè)定其酶活力。用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求出該酶在不同底物下的Km及Vmax值［19］。

1.5.3 幾丁質(zhì)酶對(duì)不同底物的酶學(xué)性質(zhì)

分別以膠體幾丁質(zhì)、水溶性殼聚糖為底物，研究幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)pH范圍、最適反應(yīng)溫度、不同金屬離子和不同表面活性劑對(duì)酶活力的影響。

1.5.3.1 反應(yīng)pH對(duì)酶活的影響

將酶液分別加入不同pH值的緩沖溶液(檸檬酸-磷酸緩沖液 pH 3.0 ～4.0，HAc-NaAc緩沖液 pH 5.0 ～ 6.0，磷酸緩沖液 pH 7.0 ～ 8.0，Na2CO3-NaHCO3緩沖液 pH 9.0 ～10.0，硼砂-Na2CO3pH 11.0 ～12.0緩沖液)中，40℃下反應(yīng)相同時(shí)間，測(cè)定幾丁質(zhì)酶降解膠體幾丁質(zhì)和水溶性殼聚糖的酶活，以酶活力最高者為100%。

1.5.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)酶活的影響

最適 pH 條件下，在不同溫度(30、40、50、60、70、80℃)下反應(yīng)相同時(shí)間，分別測(cè)定幾丁質(zhì)酶降解膠體幾丁質(zhì)和水溶性殼聚糖的酶活，以酶活最高者為100%。

1.5.3.3 不同金屬離子對(duì)酶活的影響

在最適pH和溫度條件下，用50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液配置濃度為10 mmol/L的不同金屬離子(K+、Mg2+、Ca2+、Li+、Ba2+、Ni2+、Zn2+、Na+)緩沖液，采用幾丁質(zhì)酶分別降解膠體幾丁質(zhì)和水溶性殼聚糖，測(cè)定酶活，以不含金屬離子的反應(yīng)液為100%。

1.5.3.2 不同表面活性劑對(duì)酶活的影響

用50mmol/L HAc-NaAc緩沖液配置不同濃度的表面活性劑(Trition-100、Tween-80和SDS)溶液，采用幾丁質(zhì)酶分別降解膠體幾丁質(zhì)和水溶性殼聚糖測(cè)定酶活，以不含表面活性劑的反應(yīng)液為100%。

1.6 幾丁質(zhì)酶降解產(chǎn)物的分析

1.6.1 TLC 分析

將10 mg/mL的不同底物及幾丁寡糖溶解于50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液(pH6.5)，取 0.2 mL 該溶液加30 μg幾丁質(zhì)酶于40℃下酶解5 min(膠體幾丁質(zhì)酶解1 h)，然后用玻璃硅膠板檢測(cè)酶解產(chǎn)物，展開(kāi)劑的組成是 V(正丁醇)∶V(甲醇)∶V(氨水)∶V(水)=5∶4∶2∶1。待硅膠板自然風(fēng)干后噴顯色劑(含0.5%二苯胺、0.5%苯胺的95%乙醇溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用)，于80℃下烘烤30 min，單糖和各寡糖呈現(xiàn)可見(jiàn)斑點(diǎn)［20］。

1.6.2 HPLC 分析

Prominence LC-20AD(島津，日本)，4.6 mm ×250 mm氨基液相色譜柱(依利特，中國(guó))，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=7∶3，紫外檢測(cè)器(波長(zhǎng) 195 nm)，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE

用重組質(zhì)粒pETM11-LiChi18A轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)獲得重組菌株，由該菌株所合成的幾丁質(zhì)酶蛋白經(jīng)超聲和Ni-NTA柱親和層析純化后在SDS-PAGE上呈現(xiàn)一條譜帶，純度較高，相對(duì)分子質(zhì)量約為54 kDa(見(jiàn)圖1)。從圖1中還可以看出，重組大腸桿菌表達(dá)的幾丁質(zhì)酶經(jīng)細(xì)胞破碎后，存在于上清液中，還有一部分以包涵體的形式存在于沉淀中，但包涵體形式的幾丁質(zhì)酶不具有酶活。通過(guò)前期優(yōu)化產(chǎn)酶條件，在IPTG濃度為0.05 mmol/L，20℃培養(yǎng)12 h，可使上清液中目的基因的量增加，而包涵體中的含量相對(duì)減少，但并不能完全消除包涵體的形成。

圖1 幾丁質(zhì)酶Ni-NTA柱親和層析前后的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of chitinase before and after Ni-NTA column

2.2 幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)特性

2.2.1 酶的底物特異性

采用純化后的幾丁質(zhì)酶分別降解膠體幾丁質(zhì)、N-乙?；瘹ぞ厶?DD 30%)、水溶性殼聚糖(DD 50%)和4MU-(GlcNAc)3，結(jié)果如表1所示，說(shuō)明該酶可以降解這些底物，特別是對(duì)水溶性殼聚糖(DD 50%)，雖然和熒光底物相比，其比酶活低很多，但明顯高于膠體幾丁質(zhì)和N-?；瘹ぞ厶?，說(shuō)明幾丁質(zhì)酶對(duì)水溶性殼聚糖降解能力較高。這和Masaru等的研究結(jié)果相一致，說(shuō)明幾丁質(zhì)酶能水解部分N-乙?；瘹ぞ厶牵S著乙?；鹊脑黾?，酶反應(yīng)速率增加，酶切位點(diǎn)相應(yīng)增加［21］。而對(duì) 4MU-(GlcNAc)3的比酶活為1 060.18 U/mg，比其他反應(yīng)底物的高很多，這可能是由于熒光底物溶解性好且靈敏度高的原因。

表1 幾丁質(zhì)酶對(duì)不同底物的比酶活Table 1 Specific enzyme activity of chitinase indifferent substrates

2.2.2 動(dòng)力學(xué)方程

如圖2所示，采用Lineweaver-Burk作圖法測(cè)定米氏常數(shù)，結(jié)果表明該酶對(duì)膠體幾丁質(zhì)的Km和Vmax值分別為 2.913 mg/mL 和 2.836 μmol/(min·mg)(Y=1.027 2X+0.352 6，R2=0.998 8)，對(duì)于水溶性殼聚糖的 Km和 Vmax值分別為 4.04 mg/mL和222.2 μmol/(min·mg)(Y=0.018 2X+0.004 5，R2=0.990 4)。膠體幾丁質(zhì)的Km值較小，說(shuō)明該幾丁質(zhì)酶與膠體幾丁質(zhì)的親和力較高。但對(duì)水溶性殼聚糖，雖然Km值比膠體幾丁質(zhì)大1.4倍，但其Vmax值大78倍，說(shuō)明其與幾丁質(zhì)酶的親和力較低一點(diǎn)，但其降解速率大大提高，這與其較高的?；榷^好的水溶性相關(guān)。

圖2 甲殼素酶的動(dòng)力學(xué)方程Fig.2 Kinetic equations of chitinase

2.2.3 反應(yīng)pH值對(duì)酶活的影響

通過(guò)不同底物測(cè)定幾丁質(zhì)酶在不同pH值的緩沖液體系中的酶活力，結(jié)果如圖3(A)，說(shuō)明不同底物對(duì)幾丁質(zhì)酶的最適pH不同。當(dāng)反應(yīng)底物為水溶性殼聚糖時(shí)，pH 5～8時(shí)，相對(duì)酶活力在80%以上，在pH 7左右時(shí)酶活力最高，且隨著pH的酸堿性增強(qiáng)酶活力逐漸下降。幾丁質(zhì)酶在不同的氫離子濃度下的解離程度不同，其高級(jí)結(jié)構(gòu)中S-S鍵、疏水鍵及氫鍵受到影響，從而影響幾丁質(zhì)酶構(gòu)象的變化而表現(xiàn)出不同的活性。微生物幾丁質(zhì)酶一般在pH 3～11范圍內(nèi)有不同程度的酶活，最適pH值大都在6～7［22］。當(dāng)反應(yīng)底物為膠體幾丁質(zhì)時(shí)，pH 5左右時(shí)酶活力最高，在pH 8左右時(shí)，相對(duì)酶活力在60%以上，這可能是膠體表面電荷的一定程度地增加有利于膠體的分散，但隨著pH的酸堿性增強(qiáng)酶活力逐漸下降。

2.2.4 反應(yīng)溫度對(duì)酶活的影響

圖3 不同pH(A)和不同溫度(B)對(duì)幾丁質(zhì)酶降解水溶性殼聚糖(■)和膠體幾丁質(zhì)(●)的影響(n=3)Fig.3 Effects of pH(A)and temperature(B)on chitinase with water-soluble chitosan(■)or colloidal chitin(●)(n=3)

通過(guò)不同的底物測(cè)定幾丁質(zhì)酶在不同溫度下酶的活力，結(jié)果如圖3(B)所示。Vaaje-Kolstad等以4MU-(GlcNAc)3為底物研究該幾丁質(zhì)酶的最適溫度為37℃，由于該酶來(lái)源于Lactococcus lactis ssp.lactis IL1403，其最適生長(zhǎng)溫度為30℃。當(dāng)反應(yīng)底物為水溶性殼聚糖時(shí)，反應(yīng)溫度在30～80℃之間，酶活力均在60%以上，說(shuō)明該幾丁質(zhì)酶對(duì)溫度的變化不是很敏感，60℃為酶反應(yīng)最佳溫度，可以認(rèn)為該酶為耐熱性酶［11］。但同時(shí)溫度的變化對(duì)反應(yīng)底物也會(huì)產(chǎn)生一定的影響，因此隨著底物的改變，酶的最適溫度也會(huì)發(fā)生改變。當(dāng)反應(yīng)底物為膠體幾丁質(zhì)時(shí)，在30～50℃酶活力均在80%以上，40℃為酶反應(yīng)最佳溫度，當(dāng)反應(yīng)溫度在60℃以上時(shí)酶活力逐漸下降，這可能是溫度的升高不利于膠體的分散。

2.2.5 金屬離子對(duì)酶活的影響

在反應(yīng)體系中加入10 mmol/L的不同金屬離子，比較幾丁質(zhì)酶對(duì)水溶性殼聚糖和膠體幾丁質(zhì)的酶活的影響，如表2所示。一價(jià)金屬離子K+、Li+、Na+對(duì)幾丁質(zhì)酶降解兩種底物的活性均有不同程度的抑制作用(Li+＞K+＞Na+)。而二價(jià)金屬離子 Ni2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+對(duì)膠體幾丁質(zhì)的降解有明顯的促進(jìn)作用，但對(duì)水溶性殼聚糖的降解沒(méi)有促進(jìn)作用，且Ni2+和Zn2+有一定的抑制作用。說(shuō)明金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶降解不同底物的影響存在一定差異。

表2 不同金屬離子對(duì)不同底物的酶活影響(n=3)Table 2 Effect of different metal ions on chitinase with different substrates(n=3)

2.2.6 表面活性劑對(duì)酶活的影響

在以膠體幾丁質(zhì)和水溶性殼聚糖為底物的反應(yīng)體系中加入不同濃度的表面活性劑，測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力，如表3所示。結(jié)果表明，0.5%Trition-100對(duì)幾丁質(zhì)酶的酶活力影響不大，但增加Trition-100濃度到1%時(shí)，其對(duì)幾丁質(zhì)酶活力有抑制作用。而Tween-80在其濃度為0.5%和1%時(shí)，對(duì)降解水溶性殼聚糖無(wú)明顯影響，但對(duì)降解膠體幾丁質(zhì)有促進(jìn)作用，這可能是Tween-80有利于膠體的分散。Tween-80對(duì)降解膠體幾丁質(zhì)起一定的促進(jìn)作用，而不同濃度的SDS有明顯的抑制酶活作用，特別是對(duì)膠體幾丁質(zhì)。但對(duì)兩種底物都表現(xiàn)出隨著反應(yīng)體系SDS濃度的增加，抑制作用顯著增加，這說(shuō)明SDS可能破壞該幾丁質(zhì)酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)。

表3 不同濃度表面活性劑對(duì)酶活影響(n=3)Table 3 Effect of surfactants on chitinase with different substrates(n=3)

2.3 幾丁質(zhì)酶降解產(chǎn)物的分析

該幾丁質(zhì)酶對(duì)各種幾丁寡糖和膠體幾丁質(zhì)的酶解產(chǎn)物的TLC分析結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，幾丁質(zhì)酶能完全降解幾丁四糖和幾丁六糖(GlcNAc)6，其產(chǎn)物為幾丁二糖(GlcNAc)2;但不能完全降解幾丁三糖(GlcNAc)3和幾丁五糖(GlcNAc)5，其產(chǎn)物存在單糖(GlcNAc)和幾丁二糖(GlcNAc)2，而從圖中可以知道幾丁質(zhì)酶不能降解幾丁二糖(GlcNAc)2，說(shuō)明該幾丁質(zhì)酶是內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，以內(nèi)切方式作用于甲殼聚糖主鏈內(nèi)部的β-1，4糖苷鍵。幾丁質(zhì)酶對(duì)膠體幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物的TLC圖譜可以看出，其降解產(chǎn)物主要為幾丁二糖和乙酰氨基葡萄糖。而對(duì)水溶性殼聚糖因其脫乙酰度為50%，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，降解圖譜較為復(fù)雜。所以，采用HPLC對(duì)幾丁質(zhì)酶降解膠體幾丁質(zhì)和水溶性殼聚糖的產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步分析，如圖5所示。膠體幾丁質(zhì)酶解產(chǎn)物不僅存在幾丁二糖，而且存在乙酰氨基葡萄和氨基葡萄糖，因?yàn)樘烊粠锥≠|(zhì)并不是完全乙?；?，而是乙酰氨基葡萄糖和小部分氨基葡萄糖的二元共聚物。水溶性殼聚糖的乙酰度更低，所以，其酶解產(chǎn)物主要有單糖和幾丁二糖，另外，還存在接近幾丁四糖的峰和較小的接近幾丁五糖和六糖的峰，應(yīng)該是不同聚合度和不同結(jié)構(gòu)單元的甲殼寡糖，說(shuō)明該內(nèi)切幾丁質(zhì)酶水解時(shí)只需要糖苷鍵一側(cè)至少含有1個(gè)GlcNAc基團(tuán)，即可作用于甲殼素和水溶性殼聚糖主鏈上(GlcNAc)-(GlcNAc)、(GlcNAc)-(GlcN)或者(GlcN)-(GlcNAc)的 β-1，4 糖苷鍵。

3 討論

本文以重組大腸桿菌大量表達(dá)并經(jīng)過(guò)親和層析純化獲得幾丁質(zhì)酶，比較其對(duì)不同底物的酶學(xué)性質(zhì)。郝之奎等從Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1純化后的幾丁質(zhì)酶分子量約為42 kDa;幾丁質(zhì)酶的最適溫度為40℃;最適pH為6.5;幾丁質(zhì)酶在45℃下比較穩(wěn)定，55℃以上穩(wěn)定性迅速下降;Zn2+、Cu2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+(10 mmol/L)對(duì)丁質(zhì)酶有不同程度的抑制作用，Na+、K+對(duì)幾丁質(zhì)酶有激活作用;該幾丁質(zhì)酶的Km 和 Vmax分別為22.96 mmol/L和9.066 U/mg［22］。張中等從粉棒束孢(Isaria farinosa)菌株中篩選出高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株RCEF0622純化后的幾丁質(zhì)酶分子量是38.5 kDa;該幾丁質(zhì)酶對(duì)膠體幾丁質(zhì)的Km為0.73 mg/mL;酶的最適反應(yīng)溫度是40℃;最適反應(yīng) pH 值為 4.6;Mg2+，Mn2+，Al3+，K+，Ca2+，Ba2+等金屬離子對(duì)酶活力有明顯的激活作用，尤其是Mn2+對(duì)幾丁質(zhì)酶的激活作用非常明顯;而Zn2+，Cu2+等對(duì)該酶有明顯的抑制作用;Cu2+對(duì)該酶活有較大程度的抑制作用［23］。Wang等篩選的菌株P(guān)seudomonas sp.TKU015純化所得幾丁質(zhì)酶對(duì)膠體幾丁質(zhì)降解的最適pH值為5，pH值5～7時(shí)相對(duì)酶活力均在80%以上;最適溫度為50℃，70℃時(shí)基本失活;5 mmol/L Mg2+、Zn2+對(duì)酶活力有促進(jìn)作用;0.5 mmol/L SDS可促進(jìn)該酶活性，但2 mmol/L SDS抑制該酶活性［24］。而結(jié)果表明，經(jīng)SDS-PAGE測(cè)得幾丁質(zhì)酶LIChi18A分子量約為54 kDa，該幾丁質(zhì)酶對(duì)不同底物的酶學(xué)性質(zhì)存在差異。在參考文獻(xiàn)中大多是對(duì)膠體幾丁質(zhì)為底物來(lái)討論幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)，而膠體幾丁質(zhì)的降解費(fèi)事且差異小，本實(shí)驗(yàn)對(duì)水溶性殼聚糖和膠體幾丁質(zhì)的最適pH和溫度以及金屬離子和表面活性劑的影響都分別進(jìn)行了分析，兩者作為反應(yīng)底物酶的最適條件存在較大差異。實(shí)驗(yàn)證明該幾丁質(zhì)酶對(duì)膠體幾丁質(zhì)的最適溫度為40℃;最適pH為 5，Km 和 Vmax分別為 2.913 mg/mL 和 2.836 μmol/(min·mg)，穩(wěn)定性與張中等結(jié)果較為一致。對(duì)水溶性殼聚糖的最適溫度為60℃;最適pH為7，Km和Vmax值分別為 4.04 mg/mL 和 222.2 μmol/(min·mg)，降解作用較強(qiáng)，降解速率較快，溫度穩(wěn)定性較好。Ni2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+對(duì)膠體幾丁質(zhì)的降解有明顯的促進(jìn)作用。但對(duì)水溶性殼聚糖的降解沒(méi)有促進(jìn)作用，且Ni2+和Zn2+有一定的抑制作用。Tween-80對(duì)降解膠體幾丁質(zhì)起一定的促進(jìn)作用，而不同濃度SDS有抑制酶活作用，且濃度越高抑制作用越強(qiáng)。

此外，本文還對(duì)幾丁質(zhì)酶對(duì)不同底物的降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，TLC和HPLC圖譜結(jié)果表明，通過(guò)不同底物的比較發(fā)現(xiàn)，該酶降解的主要產(chǎn)物為幾丁二糖。對(duì)膠體幾丁質(zhì)的親和力較好，該酶降解膠體幾丁質(zhì)的產(chǎn)物主要為幾丁二糖和單糖，而對(duì)水溶性殼聚糖的降解效果較好，Vmax值比膠體幾丁質(zhì)增大78倍，比酶活約是膠體幾丁質(zhì)的12倍，降解產(chǎn)物較為復(fù)雜，主要有單糖、幾丁二糖和甲殼寡糖，所以，通過(guò)該幾丁質(zhì)酶降解水溶性殼聚糖可制備多種甲殼寡糖。甲殼低聚糖的溶解性和生理功能與其聚合度有密切關(guān)系，通過(guò)控制?；群退夥磻?yīng)過(guò)程來(lái)獲得高質(zhì)量的不同聚合度的甲殼低聚糖，在醫(yī)藥、食品、化工和環(huán)保等諸多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用或具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖4 (GlcNAc)n標(biāo)樣(S)、(GlcNAc)n的降解產(chǎn)物(Cn)和膠體幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物(C7)的TLC譜圖Fig.4 TLC spectra of(GlcNAc)n standards and different hydrolysates from(GlcNAc)n and colloidal chitin

圖5 (GlcNAc)1-6標(biāo)樣(A)和膠體幾丁質(zhì)(B)和水溶性殼聚糖(C)的酶解產(chǎn)物的HPLC譜圖Fig.5 HPLC spectra of(GlcNAc)1-6 standards(A)and different hydrolysates from colloidal chitin(B)and water-soluble chitosan(C)

致謝:感謝加拿大Alberta大學(xué)G?nzle教授提供含甲殼素酶基因的質(zhì)粒。

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