李廣斌，孫艷明，宋春靜，王 玲

(天津市胸科醫(yī)院病理科 300222)

·論 著· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.17.001

骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)假孕大鼠黃體促血管生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響*

李廣斌，孫艷明，宋春靜，王 玲△

(天津市胸科醫(yī)院病理科 300222)

目的 觀察骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)移植對(duì)假孕大鼠黃體促血管生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響，探討骨髓EPC促進(jìn)假孕大鼠黃體血管新生的作用機(jī)制。方法 雌性大鼠經(jīng)137Cs全身照射后，尾靜脈移植雄性大鼠骨髓EPC行造血重建，然后制備假孕模型為移植假孕組；分別于假孕第3、7、11、15 天應(yīng)用real time PCR法檢測(cè)黃體VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF) mRNA的表達(dá)；蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)黃體VEGF、bFGF蛋白表達(dá)；CD31免疫組織化學(xué)法檢測(cè)黃體微血管密度。結(jié)果 假孕對(duì)照組(輸注等量培養(yǎng)液)及移植假孕組VEGF、bFGF表達(dá)在第7天達(dá)到最高；黃體微血管密度在第7、11天均高于第3天組水平(P<0.01)；移植假孕組VEGF、bFGF表達(dá)在第7、11天均高于同期假孕對(duì)照組(P<0.05)，且黃體微血管密度在第7、11天較同期假孕對(duì)照組高(P<0.05)。結(jié)論 骨髓EPC移植后黃體VEGF、bFGF mRNA及其蛋白表達(dá)水平升高，促進(jìn)假孕大鼠黃體血管新生。

骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞；黃體；新生血管化，病理性；務(wù)管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell,EPC)是一類單個(gè)核細(xì)胞群，主要定居于骨髓，作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在一定條件下，可以分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管新生過(guò)程。卵巢黃體具有重要的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能，其微血管呈現(xiàn)周期性增生和閉鎖及凋亡。在黃體期，其微血管呈現(xiàn)明顯增生，由此帶來(lái)的豐富血供是維持黃體微環(huán)境穩(wěn)定，執(zhí)行功能的重要保障，黃體功能不足或下降，往往與其血供減少有關(guān)。本課題組前期研究結(jié)果表明，由于骨髓EPC在假孕大鼠黃體向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)了黃體血管新生，改善了黃體血供；本次實(shí)驗(yàn)主要目的在于探討EPC移植后對(duì)假孕大鼠黃體血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)表達(dá)的影響，探討其促進(jìn)黃體血管新生的其他可能途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar雄性大鼠為供體鼠60只，體質(zhì)量200～220 g。清潔級(jí)Wistar雌性大鼠為受體鼠120只，體質(zhì)量180～200 g，由天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(津)2010-0002。

1.1.2 主要試劑 孕馬血清促性腺激素(PMSG)由寧波第二激素廠生產(chǎn)，批號(hào)：獸藥字(2006)110254564。人絨毛膜促性腺激素(HCG)由上海生物化學(xué)制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：0409013。RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；大鼠淋巴細(xì)胞分離液、CD31免疫組織化學(xué)染色試劑盒(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)；VEGF、bFGF用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)；PCR引物(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成)；蛋白免疫印記法(Western blot)所用β-actin、VEGF、bFGF兔抗鼠多克隆抗體(美國(guó) Santa公司)；BAC蛋白定量試劑盒(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.1.3 主要儀器 Real time PCR Detection System(QIAGEN Instrument,AG)；DXY-2 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 (北京六一儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Kodak公司)；RM2135切片機(jī)(德國(guó)萊卡儀器有限公司)；Olympus DP71顯微照相系統(tǒng)、BHT光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；Chemilmager TM5500凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha公司)。

1.2 方法

1.2.1 EPC的分離、移植 處死供體雄性大鼠，收集骨髓細(xì)胞懸液，分離采用大鼠淋巴細(xì)胞分離液(密度為1.077×103g/L)，2 000 r/min離心20 min，制備骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為(2～3)×107/mL，備用；受體雌性大鼠采用137Cs射線全身照射，照射前將大鼠卵巢部位用鉛皮箍綁，照射劑量為7.50 Gy，劑量率為0.74 Gy/min。照射6 h后，受體大鼠經(jīng)尾靜脈注入供體鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液1 mL(3×107個(gè))。無(wú)菌條件下采取大鼠移植第7、15天眼內(nèi)眥血，動(dòng)態(tài)觀察外周血象變化，以血象接近正常水平為造血重建成功。

1.3.2 假孕大鼠模型的制備、分組 受體大鼠于造血重建后，各組每只頸部皮下注射50 IU PMSG，48 h后每只皮下注射30 IU HCG，注射HCG 24 h后定義為假孕第1天。將受體大鼠隨機(jī)分為3 d移植假孕組、7 d移植假孕組、11 d移植假孕組和15 d移植假孕組，每組15只；另取假孕大鼠40只尾靜脈輸注等量培養(yǎng)液作為假孕對(duì)照組，分為3 d假孕對(duì)照組、7 d假孕對(duì)照組、11 d假孕對(duì)照組和15 d假孕對(duì)照組，每組10只。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)VEGF、bFGF的mRNA表達(dá) 取各組大鼠黃體組織樣品，添加液氮研磨至粉末。蛋白酶K消化過(guò)夜后，酚-氯仿-異戊醇抽提基因組DNA。VEGF上游引物：5′-GCACGTTGGCTCACTTCCAG-3′,下游引物：5′-TGG TCG GAA CCA GAA TCT TTA TCT C-3′；bFGF上游引物：5′-TTC ACA GCC TGT GCT CTAG GG-3′,下游引物：5′-GAT CGG GT CAG GTT TTG GAA A-3′；β-actin：上游引物：5′-GGG AAA TCG TGC GTG ACA TT-3′，下游引物：5′-GCG GCA GTG GCC ATC TC-3′。以基因組DNA作為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以β-actin作為參照。PCR反應(yīng)：10 μL體系中加入基因組DNA樣品1.0 μL，上、下游引物各0.1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，5 min預(yù)變性；98 ℃ 10 s，57.5 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min補(bǔ)平末端。VEGF的PCR產(chǎn)物為107 bp，bFGF的PCR產(chǎn)物為51 bp，β-actin的PCR產(chǎn)物為76 bp。PCR產(chǎn)物鑒定經(jīng)1.5%的瓊脂糖(含有0.5 mg/mL溴化乙錠)凝膠電泳后，將凝膠放入成像儀中，紫外光下自顯影，掃描成像。利用Image J計(jì)算條帶灰度值。

1.2.4 Western blot檢測(cè)黃體組織中VEGF、bFGF蛋白表達(dá) 取各組大鼠黃體組織樣品，按照BAC蛋白定量試劑盒說(shuō)明提取大鼠黃體標(biāo)本蛋白，進(jìn)行蛋白定量測(cè)定。上樣量80 μg，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；封閉2 h后滴加一抗(一抗稀釋濃度1∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜；3次洗膜后二抗室溫孵育30 min，ECL顯影，洗片。以β-actin(1∶200稀釋)作為內(nèi)對(duì)照，膠片經(jīng)掃描儀掃描后獲得圖像，用Bandleader軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白條帶與β-actin的灰度比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)黃體組織中CD31的表達(dá) CD31染色按照免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。CD31兔抗鼠多克隆抗體(1∶50稀釋)。結(jié)果判斷：CD31免疫組織化學(xué)陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。通過(guò)CD31標(biāo)記黃體血管，檢測(cè)黃體微血管密度(MVD)。

1.2.6 MVD檢測(cè)計(jì)算方法 低倍鏡下(×100)掃查整個(gè)切片，尋找3個(gè)血管高密度區(qū)，再在高倍鏡下(×400)計(jì)數(shù)這3個(gè)視野的被染成棕黃色的微血管數(shù)，對(duì)微血管的識(shí)別不需具備完整的管腔和紅細(xì)胞，具有棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇且與鄰近微血管和其他組織成分清楚分開，即為一個(gè)可計(jì)數(shù)的微血管，取此3個(gè)視野微血管數(shù)的平均值作為MVD值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠移植后生存情況 移植假孕各組大鼠在骨髓移植7d后一般狀態(tài)開始下降，各組均有動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的毛色雜亂，食欲減退，體質(zhì)量下降等，14d后一般狀態(tài)好轉(zhuǎn)，動(dòng)物存活率約65%。

2.2 各組大鼠黃體組織VEGF、bFGFmRNA表達(dá)結(jié)果 假孕對(duì)照組大鼠黃體VEGFmRNA表達(dá)在第7天達(dá)到最高，顯著高于3d假孕對(duì)照組水平(P<0.01)，第11天開始下降，表達(dá)仍高于3d假孕對(duì)照組(P<0.05)，第15天接近3d假孕對(duì)照組水平；bFGF表達(dá)也在第7天達(dá)到最高，高于3d假孕對(duì)照組水平(P<0.05)，之后開始下降，第15天接近3d假孕對(duì)照組水平，與3d假孕對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。移植假孕組VEGF表達(dá)在第7天達(dá)到最高，第11天開始下降，仍顯著高于3d移植假孕組水平(P<0.01)，第15天接近3d移植假孕組水平，且在第7、11、15天表達(dá)均高于同期假孕對(duì)照組(P<0.05)；移植假孕組bFGF表達(dá)與VEGF呈現(xiàn)相似趨勢(shì)，表現(xiàn)為第7天最高，之后下降，且在第7、11天表達(dá)高于同期假孕對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠黃體組織VEGF、bFGF的mRNA表達(dá)±s)

a：P<0.05，b：P<0.01，與3 d組比較；c：P<0.05，與同期假孕對(duì)照組比較。

表2 各組大鼠黃體組織VEGF、bFGF的蛋白表達(dá)±s)

a：P<0.05，b：P<0.01，與3d組比較；c：P<0.05，與同期假孕對(duì)照組比較。

1、2、3、4分別為第3、7、11、15天組。

圖1 各組大鼠黃體組織VEGF、bFGF蛋白表達(dá)

2.3 各組大鼠黃體組織VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)結(jié)果 假孕對(duì)照組黃體VEGF蛋白表達(dá)在第7天達(dá)到高峰，與3d假孕對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，之后持續(xù)下降；移植假孕組VEGF表達(dá)亦于第7天達(dá)到高峰，與3d假孕對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，第11天下降，與3d移植假孕組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，到第15天表達(dá)最低；且在第7、11天組VEGF表達(dá)高于同期假孕對(duì)照組(P<0.05)。bFGF表達(dá)在假孕對(duì)照組及移植假孕組均在第7天最高，與3d組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)，之后持續(xù)下降，到第15天表達(dá)最低；在第7天，移植假孕組bFGF表達(dá)較假孕對(duì)照組升高(P<0.05)，見表2，圖1。

2.4 各組大鼠黃體微血管MVD檢測(cè)結(jié)果 假孕對(duì)照組黃體微血管密度在第7天最高，隨后下降，第7、11天與第3天組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，第15天表達(dá)最低；移植假孕組黃體微血管密度變化趨勢(shì)與假孕對(duì)照組相似，且第7、11天移植假孕組黃體微血管密度高于同期假孕對(duì)照組(P<0.05)，見表3、圖2。

表3 CD31免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠黃體組織微血管MVD檢測(cè)結(jié)果±s)

a:P<0.01，與3 d組比較；b：P<0.05，與同期假孕對(duì)照組比較。

1：3 d，2：7 d，3:11 d；4:15 d。

圖2 移植假孕組大鼠黃體組織微血管CD31免疫組織化學(xué)染色 (×400)

3 討 論

血管新生是指在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中或創(chuàng)傷修復(fù)、缺血、缺氧和炎癥等情況下,原有微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)出芽、遷移、增殖與基質(zhì)重塑等最終形成新毛細(xì)血管的過(guò)程。目前研究發(fā)現(xiàn)，EPC經(jīng)動(dòng)員歸巢到目的器官是促進(jìn)組織血管新生的有效途徑[1]。黃體作為發(fā)生生理性血管新生的少數(shù)幾個(gè)成年組織之一，在黃體期，其微血管呈現(xiàn)明顯增生，這個(gè)過(guò)程對(duì)于維持黃體功能至關(guān)重要[2]。作者之前的研究觀察到，EPC歸巢到黃體后，可以通過(guò)分化為內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)黃體血管新生；本次實(shí)驗(yàn)觀察到，在假孕對(duì)照組及移植假孕組大鼠黃體中，VEGF和bFGF的表達(dá)在總體上呈現(xiàn)類似的先升后降的趨勢(shì)；同時(shí)，移植假孕組VEGF在mRNA及蛋白的表達(dá)上，在第7、11天高于同期假孕對(duì)照組(P<0.05)；bFGF的表達(dá)在第7天高于同期假孕對(duì)照組(P<0.05)；黃體微血管密度在第7、11天高于同期假孕對(duì)照組(P<0.05)。

VEGF是一種極強(qiáng)的血管增生促進(jìn)劑，在絕大多數(shù)動(dòng)物(如小鼠和人類)的黃體化顆粒細(xì)胞中都可以檢測(cè)到VEGF mRNA[3],而且在顆粒細(xì)胞黃體化過(guò)程中,VEGF的表達(dá)量顯著增加[4]。bFGF是一種作用廣泛的細(xì)胞因子，主要分布于神經(jīng)組織、垂體、腎上腺、卵巢和胎盤，誘導(dǎo)新生血管形成[5]。卵巢中的bFGF主要來(lái)源于黃體顆粒細(xì)胞，卵泡膜細(xì)胞等，bFGF通過(guò)自分泌和旁分泌形式調(diào)節(jié)血管新生，且與VEGF關(guān)系密切，在體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中給予bFGF,可以發(fā)現(xiàn)VEGF的表達(dá)增加,如果阻斷了VEGF的表達(dá),bFGF就不能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管[6]。另有報(bào)道，體外培養(yǎng)的骨髓單個(gè)核細(xì)胞具有分泌VEGF及bFGF、胰島素樣生長(zhǎng)因子的能力[7]；骨髓單個(gè)核細(xì)胞能夠釋放VEGF和單核細(xì)胞趨化蛋白-1,并發(fā)現(xiàn)EPC在分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程中能分泌bFGF[8]。本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠假孕模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)行同種異體EPC移植，通過(guò)觀察黃體VEGF、bFGF mRNA及蛋白的表達(dá)，觀察黃體微血管密度的變化，綜合評(píng)價(jià)EPC移植對(duì)假孕大鼠黃體促血管生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)移植EPCs促進(jìn)黃體血管新生，其機(jī)制可能并不僅僅是本研究之前觀察到的單純自身分化作用，EPCs同時(shí)也以自分泌和旁分泌的形式影響著局部血管生成因子的釋放，促進(jìn)了黃體VEGF及bFGF的表達(dá)，從而促進(jìn)了黃體血管的新生，進(jìn)一步探討了EPCs移植促進(jìn)黃體血管新生的可能機(jī)制，為EPCs移植緩解黃體血管新生不足導(dǎo)致的黃體功能下降和不全提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effection of bone marrow endothelial progenitor cell transplantation on the expression of corpus luteum angiogenic growth factors*

LiGuangbin，SunYanming，SongChunjing，WangLing△

(DepartmentofPathology,TianjinChestHospital,Tianjin300222,China)

Objective To observe the effection of bone marrow endothelial progen-itor cells(EPCs) transplantation on corpus luteum angiogenic growth factors expression,and investigate the mechanism of the EPCs to promote the angiogenesis of pseudopregnancy rat corpus luteum.Methods Female rats radiated by137Cs were transplanted EPCs which came from male rat via tail vein.The pseudocyesis model of transplantated female rat was established after hematopoietic reconstitution,which named as pseudopregnancy group.On 3rd,7th,11th and 15th day,Vascular endothelial growth factor(VEGF) and basic fibroblast growth factor(bFGF) mRNA were tested through the method of RT-PCR,their protein expression were tested through the method of Western blotting,and the the corpus luteum capillary density were tested through CD31 immunohisto chemistry.Results In pseudopregnancy control groups and transplantation pseudopr-egnancy groups,the VEGF、bFGF expression achieved the peak on 7th day.The corp-us luteum capillary density was higher than that of 3rd day group(P<0.01)on the 7th and 11th day group.The expression of VEGF and bFGF of transplantation pseudopregnancy group were higher than that of pseudopregnancy control group on 7th,11th day(P<0.05),the corpus luteum capillary density of transplantation pseudopregnancy group were higher than that of pseudopregnancy control group on 7th and 11th day(P<0.05).Conclusion EPCs transplantation can increase the expression of VEGF and bFGF mRNA,and promote the growth of corpus luteum angiogenesis.

bone marrow endothelial progenitor cell；corpus luteum;angiogenesis,pathologil;vascular endothelial growth factor A；fibroblast growth factor 2

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(30873281)。 作者簡(jiǎn)介：李廣斌(1975-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事病理學(xué)研究?！?/p>

，Tel:(022)27386453；E-mail:minniezjj@sina.com。

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