初茂林，張春影，修有成

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外二科，黑龍江哈爾濱 150086；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外三科，黑龍江哈爾濱 150001)

·基礎(chǔ)研究·

切斷陰部神經(jīng)建立女性壓力性尿失禁大鼠模型的可行性實(shí)驗(yàn)研究

初茂林1，張春影1，修有成2

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外二科，黑龍江哈爾濱 150086；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外三科，黑龍江哈爾濱 150001)

目的 探討切斷陰部神經(jīng)建立女性壓力性尿失禁動(dòng)物模型的可行性。方法 選取健康雌性青春期大鼠40只，隨機(jī)分為陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組、對(duì)照組各20只，所有樣本均進(jìn)行噴嚏試驗(yàn)、腹部漏尿點(diǎn)壓力檢測(cè)及尿道組織學(xué)檢查。結(jié)果 陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組腹部漏尿點(diǎn)壓力比手術(shù)對(duì)照組降低、噴嚏試驗(yàn)陽性；HE染色及免疫組化試驗(yàn)均為陽性。對(duì)照組噴嚏試驗(yàn)陰性。壓力性尿失禁模型建立成功率為85%。結(jié)論 切斷陰部神經(jīng)建立女性壓力性尿失禁大鼠模型是可行的，在模型的制作中組織學(xué)檢查提供了可靠的病理學(xué)基礎(chǔ)。

壓力性尿失禁；動(dòng)物模型；腹部漏尿點(diǎn)壓力；噴嚏實(shí)驗(yàn)；大鼠

女性壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)是一種中老年婦女的常見病[1]。國際尿控學(xué)會(huì)(International Continence Society，ICS)對(duì)SUI定義是指膀胱壓力大于最大尿道壓力時(shí), 逼尿肌沒有收縮的情況下尿液從外尿道外口不自主流出。尿失禁多數(shù)在患者咳嗽或運(yùn)動(dòng)腹壓增大時(shí)發(fā)生，患者多為中老年婦女。流行病學(xué)資料顯示，尿失禁總患病率11%～57%，我國尿失禁患病率約26.7%，SUI為18.6%[1]，年齡增長、盆底肌肉損傷等是引起SUI的常見原因，這些因素可以導(dǎo)致盆底肌肉，韌帶結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致尿道和陰道的解剖異常[2-3]。其他因素還包括肥胖、慢性咳嗽、多產(chǎn)、吸煙和便秘等，經(jīng)陰道分娩是SUI產(chǎn)生的最常見的原因。現(xiàn)今壓力性尿失禁的治療方法都存在不同的缺陷，故研究出副作用少、治愈率高的治療方法非常重要[4-5]。建立SUI動(dòng)物模型可以更好地研究SUI的發(fā)病機(jī)制，更直觀地評(píng)價(jià)臨床各種治療SUI方法的療效和并發(fā)癥，為治療方案的進(jìn)一步改進(jìn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性Wistar 大鼠40只，鼠齡10～12周，體重200～250 g。隨機(jī)分為陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組、手術(shù)對(duì)照組各20只。

1.1.2 試劑 PGP9.5兔抗鼠酶標(biāo)抗體，兔二步法檢測(cè)試劑盒，DAB顯色劑，PBS緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 ①麻醉時(shí)應(yīng)用水合氯醛，濃度為10%，按每公斤體重3 mL的劑量進(jìn)行腹腔內(nèi)注射[6]；②備皮，術(shù)區(qū)75%乙醇浸泡3 min消毒，大鼠俯臥位在手術(shù)臺(tái)上固定；③在大鼠背側(cè)碘伏消毒后縱行切開皮膚約1.5 cm，打開肌層，分離脊柱兩側(cè)的肌肉，在坐骨直腸窩內(nèi)，仔細(xì)尋找，可以找到略黃色的坐骨神經(jīng)，沿坐骨神經(jīng)向遠(yuǎn)端分離，在坐骨神經(jīng)起源的遠(yuǎn)端可以找到通向尿道膀胱方向的神經(jīng)分支，為陰部內(nèi)神經(jīng)，切斷切除陰部內(nèi)神經(jīng)約2～3 mm；④對(duì)照組手術(shù)方法同前，但神經(jīng)不切斷。⑤常規(guī)飼養(yǎng)2周。

1.2.2 結(jié)果判定方法 ①噴嚏試驗(yàn)：將大鼠固定，首先排空膀胱，向膀胱內(nèi)灌注膀胱容量1/2的美蘭鹽水混合液，然后剪取一段鼠須刺激大鼠鼻腔，誘導(dǎo)大鼠噴嚏反射，觀察大鼠尿道口有無美蘭液流出，有美蘭液溢出為陽性，沒有美蘭液溢出為陰性。②腹部漏尿點(diǎn)壓力檢測(cè)：準(zhǔn)備尿動(dòng)力學(xué)檢查儀器，10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥固定大鼠；尿道外口用75%的乙醇消毒，然后用眼科小鑷子提起，硬膜外導(dǎo)管應(yīng)用石蠟油完全潤滑，插入尿道，深度約3 cm，固定好，先把膀胱內(nèi)的尿液排出，輸液泵連接在導(dǎo)管另一端，檢查無漏夜后，緩慢輸入37 ℃美蘭和生理鹽水的混合液，并對(duì)尿道外口進(jìn)行觀察，尿道外口有美蘭液流出時(shí)記錄輸入膀胱液體量，即測(cè)出最大膀胱容量；應(yīng)用硬膜外導(dǎo)管排空膀胱，再灌注0.5倍膀胱容量的美蘭生理鹽水混合液，拔出導(dǎo)管。在大鼠直腸內(nèi)插入F3氣囊導(dǎo)管，氣囊內(nèi)注入0.15 mL生理鹽水導(dǎo)管另一端連接壓力轉(zhuǎn)換器測(cè)定壓力，用手在大鼠腹壁上緩慢加壓， 觀察膀胱壓力上升情況; 注意監(jiān)測(cè)尿道外口變化，當(dāng)有尿液溢出尿道口時(shí)，馬上記錄下當(dāng)時(shí)的膀胱壓力，這便是測(cè)出的腹部漏尿點(diǎn)壓力。③組織學(xué)檢測(cè)：噴嚏試驗(yàn)，尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)完畢后，取大鼠膀胱頸尿道括約肌處組織，4%多聚甲醛固定約18～24 h，制備石蠟切片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0，數(shù)據(jù)采用 表示，應(yīng)用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 噴嚏試驗(yàn)結(jié)果 陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組動(dòng)物20只，誘發(fā)噴嚏時(shí)有17只尿道口有尿液流出，陽性率為85%(17/20)；對(duì)照組大鼠誘發(fā)噴嚏時(shí)尿道口未發(fā)現(xiàn)流出美蘭液。陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組陽性率明顯高于手術(shù)對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型成功率85%。

2.2 尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果 陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組的最大膀胱容量、漏尿點(diǎn)壓力均小于手術(shù)對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表1)。

表1 兩組尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

2.3 組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果 HE染色檢查可見陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組與對(duì)照組相比，尿道松弛、肌纖維變??；PGP9.5免疫組化檢測(cè)可見陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組神經(jīng)標(biāo)記的棕色顆粒明顯減少，即組織內(nèi)神經(jīng)肌肉結(jié)合部密度降低、去神經(jīng)化成功(見圖1、圖2)。

圖1 陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組與手術(shù)對(duì)照組HE染色圖(×40)

圖2 陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組與手術(shù)對(duì)照組PGP9.5免疫組化圖(×400)

3 討 論

流行病學(xué)研究結(jié)果，女性尿失禁發(fā)病率將隨著年齡的增長而升高。有調(diào)查顯示：大于20歲的女性分年齡段調(diào)查，50歲為尿失禁總患病率的第一個(gè)高峰，約為30%，超過50歲后患病率會(huì)有輕微的下降；患病率第二個(gè)高峰在到70歲后，該年齡段女性的患病率會(huì)升高至35%～40%。另外調(diào)查還顯示：不僅尿失禁患病率隨著年齡的增加而增加，而且尿失禁病情也隨著患者年齡的增大而加重。數(shù)據(jù)顯示：嚴(yán)重性壓力性尿失禁患者中， 25～44歲年齡段占比例為10%，45～59歲年齡段內(nèi)為15%,60歲以上可高達(dá)33%；而急迫性尿失禁25～44歲年齡段占比例為8%，45～59歲年齡段內(nèi)為18%,60歲以上可高達(dá)45%；混合性尿失禁25～44歲年齡段占比例為19%，45～59歲年齡段內(nèi)為33%,60歲以上可高達(dá)53%。

在參閱相關(guān)文件的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)對(duì)建立大鼠SUI模型的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行了更加深入的檢測(cè)，應(yīng)用目前比較權(quán)威、熱門的蛋白神經(jīng)產(chǎn)物9.5即PGP9.5進(jìn)行免疫組織化學(xué)，更進(jìn)一步鑒定了模型成功[7-9]，在不斷的努力中確定了該建模條件。在開始的模型的選擇上，本著研究SUI的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)行SUI治療的設(shè)計(jì)觀念。模型建立成功率有較大差異，比如：陰道擴(kuò)張成功率為39%，陰部神經(jīng)壓迫成功率為46%，而陰部神經(jīng)切斷術(shù)成功率則可達(dá)100%[10]；陰道擴(kuò)張模擬產(chǎn)傷模型的恢復(fù)性強(qiáng)，有研究表明，模擬妊娠，絕經(jīng)等條件需要時(shí)間較長，并且存在一定的恢復(fù)率[11-12],神經(jīng)損傷以后會(huì)緩慢的恢復(fù)，這樣會(huì)導(dǎo)致肌肉的緩慢修復(fù)[13]；離斷坐骨神經(jīng)或者陰部神經(jīng)的方法建模方便，周期較快， 模型制作成功率高，很少短期恢復(fù)[14]；切斷陰部內(nèi)神經(jīng)制作模型，提高了特異性，成功率高[15]， 因此本實(shí)驗(yàn)依照此方法為基礎(chǔ)，考慮再增加特異性因素，離斷支配尿道括約肌的陰部內(nèi)神經(jīng)，同時(shí)切除約2 mm長度神經(jīng)，防止神經(jīng)再生，使模型的穩(wěn)定性及特異性得到提高，為SUI的研究提供合格材料，從而探究其治療方法。

檢驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒εc否模型對(duì)本實(shí)驗(yàn)的成敗非常重要成功。最大膀胱容量和漏尿點(diǎn)壓力檢測(cè)可以側(cè)面反映儲(chǔ)尿功能的改變，對(duì)診斷壓力性尿失禁有意義[16]。在儲(chǔ)尿期女性對(duì)尿液的控制能力決定于尿道壓，主要決定于括約肌，同時(shí)盆底和尿道周圍肌肉的功能以及尿道的長短都會(huì)對(duì)尿道有影響。通常動(dòng)物的儲(chǔ)尿能力可以通過漏尿點(diǎn)壓力和最大膀胱容量評(píng)價(jià)。在其他條件完全相同的情況下，陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組的最大膀胱容量和漏點(diǎn)壓均小于手術(shù)對(duì)照組，即陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組的最大儲(chǔ)尿能力小于手術(shù)對(duì)照組。提示可以認(rèn)為通過雙側(cè)陰部內(nèi)神經(jīng)切斷術(shù)，使降低了大鼠的儲(chǔ)存尿液的能力。

實(shí)驗(yàn)中需要給大鼠尿道插管以方便測(cè)定大鼠的最大膀胱容量和膀胱漏尿點(diǎn)壓力。首先我們要對(duì)雌性大鼠的尿道解剖具有熟悉的認(rèn)知，在插管中要在導(dǎo)管上涂抹足量潤滑劑以順利插管。選擇容易獲得的硬膜外導(dǎo)管和F3水囊測(cè)壓管為測(cè)壓管，測(cè)壓管插入大鼠直腸中，測(cè)量大鼠漏尿時(shí)的直腸壓，以直腸壓作為腹部漏尿點(diǎn)壓，減少中間誤差，提高了壓力測(cè)定的準(zhǔn)確性[16]。確保注射器導(dǎo)管內(nèi)灌注和測(cè)壓，在灌注中要注意緩慢勻速充盈膀胱，盡量降低將刺激膀胱攣縮。在研究過程中，外界干擾條件(如呼吸或溫度等)都會(huì)影像波形圖，會(huì)有大小振幅的表現(xiàn)，所以統(tǒng)計(jì)壓力值時(shí)，要2次測(cè)量求平均值。結(jié)果中顯示：和對(duì)照組比較實(shí)驗(yàn)組尿流動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為膀胱最大容量減少，漏尿點(diǎn)壓力降低，這代表尿道閉合不全，噴嚏試驗(yàn)陽性率增高。

模型的成功率可通過噴嚏試驗(yàn)的陽性率評(píng)價(jià)，有研究提出[17]： SUI動(dòng)物模型常規(guī)成功率為40%～64%[18]。從本研究來看，在建模方法改進(jìn)后，本研究模型成功率高達(dá)85%。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，陰部內(nèi)神經(jīng)組死亡大鼠3只，分別因?yàn)槭中g(shù)和不明原因，對(duì)照組無死亡例，總的來說模型的建立過程和結(jié)果是非常成功。

特別是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組和手術(shù)對(duì)照組的比較中，陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組的PGP9.5顯色明顯減少，提示了PGP9.5是綜合性的肌肉神經(jīng)標(biāo)記，這種標(biāo)記可用于研究肌肉神經(jīng)損傷恢復(fù)變化[19-20]。進(jìn)行PGP9.5免疫組化，我們基本可以顯示所有的肌肉的末梢神經(jīng)。另外，在我們研究的觀察時(shí)間范圍內(nèi)，在神經(jīng)肌肉，PGP9.5顯示出的手術(shù)對(duì)照組神經(jīng)的數(shù)量明顯高于陰部內(nèi)神經(jīng)切斷組，這對(duì)尿道括約肌末端神經(jīng)肌肉的受損后如何修復(fù)的研究有很大幫助。

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(編輯 何宏靈)

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Feasibility of establishing pudendal nerve cut rat model of female stress urinary incontinence

CHU Mao-lin, ZHANG Chun-ying, XIU You-cheng

(1.the Second Department of Urology,the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086; 2.the Third Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China)

Objective To explore the feasibility of establishing animal model of stress urinary incontinence (SUI) by bilateral transection of the pudendal nerve. Methods A total of 40 healthy female WT rats were randomly divided into two groups, bilateral pudendal nerve transection group (PNT group,n=20), and control group (n=20). Bilateral pudendal nerves were transected in the PNT group, and isolated in the control group. The sneeze test, abdominal leak point pressure (ALPP) test and histological examination were performed in all animals.Results The maximum capacity and ALPP of the PNT group were less than those of the control group. The sneeze test was positive in the PNT group while negative in control group. Both HE staining and immunohistochemistry examination were positive in the PNT group. The success rate of SUI animal model was 85%. Conclusion It is feasible and reproducible to establish rat models of SUI, but the workload is rather large. Histological examination can provide solid evidence for the successful establishment of SUI animal models.

stress urinary incontinence; animal model; abdominal leak point pressure; sneeze test; rat

2015-03-31

2015-08-25

張春影(1963-)，主任醫(yī)師，博士，研究方向?yàn)樵l(fā)性早泄、前列腺疾病.E-mail：zyzhanghli@sohu.com

初茂林(1983-)，男(漢族)，碩士，住院醫(yī)師.研究方向?yàn)閴毫δ蚴Ы?、腎腫瘤.E-mail：chumaolin@163.com

R695.1

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.010.016