李 雙，張 磊，王尚乾，秦 超

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇南京 210029)

·基礎(chǔ)研究·

腫瘤睪丸抗原乳酸脫氫酶C蛋白表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇南京 210029)

目的 研究腫瘤睪丸抗原LDHC蛋白表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲遷移等生物學(xué)功能的影響。方法 采用siRNA技術(shù)在腎癌細(xì)胞系Caki-1中降低乳酸脫氫酶C(LDHC)的表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)研究LDHC蛋白表達(dá)水平對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲遷移等生物學(xué)行為的影響。同時(shí)測(cè)定LDHC表達(dá)降低后，MMP-9蛋白的表達(dá)水平及培養(yǎng)基中乳酸的濃度。結(jié)果 當(dāng)LDHC表達(dá)水平下調(diào)后，腎癌細(xì)胞的侵襲遷移能力減弱，MMP-9蛋白表達(dá)水平及培養(yǎng)基中乳酸濃度減低，與空白組及陰性組比較差異顯著(P<0.05)。結(jié)論 LDHC的表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞的功能有一定的影響，LDHC的表達(dá)降低，腎癌細(xì)胞的侵襲遷移能力減弱。其可能機(jī)制為L(zhǎng)DHC能促進(jìn)MMP-9的表達(dá)和乳酸的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)腎癌細(xì)胞侵襲及遷移能力。

腎細(xì)胞癌；LDHC；siRNA；侵襲；遷移

腫瘤睪丸抗原(cancer-testis antigen, CTA)是一類腫瘤特異性抗原，只在腫瘤中表達(dá)，在正常組織(睪丸和胎盤(pán)除外)中均不表達(dá)，由于這種與腫瘤相關(guān)的特異性表達(dá)方式，使其成為特異性免疫治療的理想靶分子[1]。目前，關(guān)于這一類基因在腎癌中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞功能影響的研究在國(guó)內(nèi)外都很少。我們前期利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)10例行腎癌根治患者的腎癌組織標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，隨后我們利用生物信息學(xué)分析了最新的人體多組織臟器的二代測(cè)序數(shù)據(jù)[2]并將其代入PageFinder軟件[3]中計(jì)算并得到了1 152個(gè)人類睪丸特異性表達(dá)基因。將腎癌蛋白與人類睪丸特異性表達(dá)基因進(jìn)行交叉重合從中找到了本文研究的乳酸脫氫酶C (lactate dehydrogenase C,LDHC)。LDHC為乳酸脫氫酶(LDH)同工酶之一，催化丙酮酸和乳酸之間的可逆反應(yīng)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)由同源亞基組成的乳酸脫氫酶有3種：LDHA、LDHB以及LDHC。前兩種乳酸脫氫酶廣泛分布于各種組織，LDHC則主要分布在睪丸組織中。我們通過(guò)對(duì)腎癌細(xì)胞株Caki-1進(jìn)行免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)LDHC在腎癌細(xì)胞株中有表達(dá)且主要定位于細(xì)胞質(zhì)，胞核可能有弱表達(dá)，核仁無(wú)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用siRNA技術(shù)沉默LDHC基因在腎癌細(xì)胞株Caki-1中的表達(dá)，并進(jìn)一步研究LDHC蛋白表達(dá)水平對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲、遷移等生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎癌細(xì)胞株Caki-1購(gòu)于上海細(xì)胞生物研究所，兔抗人單克隆抗體LDHC購(gòu)于Abcam公司；β-actin購(gòu)于Santa cruz公司；MMP-9抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔二抗購(gòu)于中杉金橋公司；Negative control siRNA購(gòu)于上海吉瑪公司；Lipofectamin2000購(gòu)于Invitrogen公司；millicell小室購(gòu)于Millipore公司；基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司；乳酸測(cè)試盒購(gòu)于南京建成公司。上海吉瑪公司針對(duì)LDHC序列設(shè)計(jì)合成3條siRNA，我們采用Western驗(yàn)證篩選出一條有效序列，正義鏈：5′-CAGAAACACUUUGGAAUAUTT-3′；反義鏈：5′-AUAUUCCAAAGUGUUUCUGTT-3′，根據(jù)說(shuō)明書(shū)用LDEPC水將干粉狀siRNA稀釋。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 與傳代人腎癌細(xì)胞株Caki-1用含10%(體積分?jǐn)?shù))小牛血清的McCoy’s5A培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液；細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后用0.25%胰蛋白酶消化1 min左右，10%小牛血清的5A培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清按1×105/mL的濃度傳代。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 于轉(zhuǎn)染前24 h 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caki-1細(xì)胞，經(jīng)消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×105個(gè)/mL，接種于6孔板，溫箱培養(yǎng)，待細(xì)胞濃度至70%后轉(zhuǎn)染。設(shè)置空白組、陰性組(negative control siRNA轉(zhuǎn)染組)、實(shí)驗(yàn)組(LDHC siRNA轉(zhuǎn)染組)。配置A、B液，A液為5 μL siRNA+250 μL DMEN，空白組為300 μL DMEM；B液為5 μL Lipofectamin 2000+250 μL DMEM，室溫5 min，將A液和B液混合，室溫放置15 min，將混合液加入6孔培養(yǎng)板中，放入CO2溫箱培養(yǎng)，8 h后換液，置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

1.4 侵襲、遷移實(shí)驗(yàn) 用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液100 μL包被millicell小室底部膜的上室面，37 ℃風(fēng)干。取轉(zhuǎn)染后48 h各組細(xì)胞，消化離心，用PBS洗2遍，加入無(wú)血清5A培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×105/mL，取各組細(xì)胞200 μL加入millicell小室，下室加入500 μL含20%FBS的5A培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)32 h。孵育結(jié)束后稍用PBS洗，用棉簽擦去millicell小室上室面基質(zhì)膠和細(xì)胞，將小室浸入4%甲醛溶液中固定15 min，PBS清洗3次，然后于蘇木精中10 min，再用PBS清洗3次。200倍光鏡下計(jì)數(shù)小室膜背面的細(xì)胞。遷移實(shí)驗(yàn)，小室內(nèi)不鋪膠，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.5 乳酸濃度測(cè)量 Caki-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，PBS 清洗2 次，每孔換成2 mL新鮮完全培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清，離心去除細(xì)胞碎片后用乳酸試劑盒檢測(cè)產(chǎn)生乳酸的量。同時(shí)將孔里的細(xì)胞用胰酶消化，進(jìn)行計(jì)數(shù)，用產(chǎn)生的乳酸量除以相應(yīng)的細(xì)胞總數(shù)，即可得出平均每106個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)的乳酸產(chǎn)生量。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞LDHC蛋白水平的變化 Caki-1細(xì)胞經(jīng)siRNA作用48 h后，提取蛋白行Western blot，LDHC為目的蛋白，β-actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)組LDHC蛋白表達(dá)量較陰性組或空白組顯著降低(P<0.05)，陰性組LDHC蛋白表達(dá)水平較空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖1)

圖1 各處理組Caki-1細(xì)胞經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染48 h后蛋白表達(dá)量

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞侵襲、遷移能力的變化 Caki-1細(xì)胞經(jīng)siRNA作用48 h后，實(shí)驗(yàn)組侵襲遷移穿膜細(xì)胞數(shù)較空白組、陰性組顯著下降(P<0.05)，后兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。轉(zhuǎn)染后Caki-1細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯抑制(圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基乳酸濃度的變化 Caki-1細(xì)胞經(jīng)siRNA作用48h后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中乳酸濃度較空白組、陰性組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 圖3)。

2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞MMP-9蛋白水平的變化 各處理組Caki-1細(xì)胞經(jīng)siRNA作用48 h后，提取蛋白行Western blot，MMP-9為目的蛋白，β-actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)組MMP-9蛋白表達(dá)量較陰性組和空白組顯著降低(P<0.05)，陰性組MMP-9蛋白表達(dá)水平較空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)。

圖2 光學(xué)顯微鏡下腎癌細(xì)胞侵襲和遷移穿膜細(xì)胞數(shù)的變化(HE,×200)

圖3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞生成乳酸能力變化

圖4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞MMP-9蛋白水平變化

3 討 論

LDHC的基因位于人類染色體11p15.1區(qū)，以多分子四聚體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。與大部分NAD依賴的乳酸脫氫酶相同，LDHC的分子量在140 ku左右。LDHC是第一個(gè)在男性生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的具有睪丸特異性的同工酶[4]。與LDHA、LDHB相比，LDHC在動(dòng)力學(xué)及酶底物上有其不同之處，Km值測(cè)定顯示其與乳酸有較高的親合力，而且其酶活性具有很好的熱穩(wěn)定性[5]。目前，尚無(wú)LDHC在腎癌中表達(dá)及對(duì)腎癌細(xì)胞功能影響的相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用siRNA技術(shù)成功誘導(dǎo)Caki-1細(xì)胞系中LDHC基因的下調(diào)。Western結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組LDHC的表達(dá)明顯低于空白和陰性組，且空白和陰性組無(wú)明顯差異，從而證實(shí)LDHC基因被成功下調(diào)。

我們使用的Caki-1細(xì)胞是惡性腎癌細(xì)胞，具有侵襲和遷移的能力。根據(jù)millicell小室侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組侵襲和遷移穿膜細(xì)胞數(shù)較陰性組、空白組均顯著下降，而后兩者穿膜細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見(jiàn)LDHC蛋白對(duì)Caki-1細(xì)胞穿膜能力有明顯增強(qiáng)作用。其具體機(jī)制可能為L(zhǎng)DHC能促進(jìn)MMP-9的表達(dá)和乳酸的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)了Caki-1的侵襲及遷移能力。

侵襲和遷移是惡性腫瘤的重要特征，而腫瘤細(xì)胞具備這種能力的先決條件是破壞基底膜的完整性，這一過(guò)程是腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外間質(zhì)相互作用的結(jié)果。MMP-9是一種依賴金屬離子-鋅的蛋白水解酶，能分解基底膜的骨架成分-Ⅳ型膠原。基底膜中的膠原蛋白被分解，其結(jié)構(gòu)被破壞，從而失去對(duì)腫瘤的阻隔作用。多篇文獻(xiàn)報(bào)道MMP-9與多種腫瘤的侵襲和遷移密切相關(guān)[6-9]。本實(shí)驗(yàn)中，Caki-1細(xì)胞中LDHC被成功下調(diào)后，與陰性組和空白組相比，實(shí)驗(yàn)組MMP-9蛋白表達(dá)量明顯降低，表明細(xì)胞內(nèi)LDHC表達(dá)下調(diào)后可能通過(guò)減少M(fèi)MP-9蛋白表達(dá)從而抑制腎癌細(xì)胞的侵襲遷移能力。

大量研究表明即使在正常氧條件下，腫瘤細(xì)胞也優(yōu)先通過(guò)糖酵解途徑分解葡萄糖獲取能量，消耗大量葡萄糖的同時(shí)產(chǎn)生乳酸，此現(xiàn)象稱為“有氧糖酵解”，又被命名為“Warburg 效應(yīng)”[10]。Warburg 效應(yīng)在多種腫瘤中存在，被認(rèn)為是腫瘤的基本特征之一?；谶@種效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞通過(guò)活躍的糖酵解代謝產(chǎn)生大量丙酮酸。LDH作為糖酵解通路最后一步的調(diào)節(jié)酶，可以將大量堆積的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸,進(jìn)而讓局部pH降低。近年的研究顯示，腫瘤的局部酸性微環(huán)境與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性[11-12]。VéGRA[13]等發(fā)現(xiàn)乳酸可以通過(guò)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，引起IκBα的降解和磷酸化，進(jìn)而刺激自分泌核轉(zhuǎn)錄因子κB/白細(xì)胞介素8通路引起細(xì)胞的遷移。GOETZE等[14]通過(guò)Boyden小室分析研究乳酸對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移性的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度乳酸能抑制單核細(xì)胞遷移和細(xì)胞因子釋放，導(dǎo)致免疫逃避，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)中，利用siRNA技術(shù)沉默LDHC的表達(dá)之后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中乳酸濃度較陰性組和空白組均有所降低，表明細(xì)胞內(nèi)LDHC表達(dá)下調(diào)后可通過(guò)減少乳酸生成從而抑制腎癌細(xì)胞的侵襲遷移能力。

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的2%～3%[15]。手術(shù)切除是目前治療腎癌唯一有效的方法，但仍有近1/3的腎癌患者在確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)機(jī)會(huì)，其5年生存率不足20%。而即使接受了根治性腎切除術(shù)，局限性腎癌的患者術(shù)后仍有20%～40%復(fù)發(fā)率[16]。由于腎癌對(duì)放、化療均不敏感，因此選擇有效的特異性免疫治療靶向分子可以用于晚期腎癌術(shù)后的輔助治療。因此深入探討腎癌中的LDHC蛋白表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其對(duì)腎癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，對(duì)評(píng)估預(yù)后以及指導(dǎo)患者的個(gè)體化治療具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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(編輯 何宏靈)

Effect of cancer-testis antigen LDHC on the invasion and metastasis of renal cell carcinoma

(the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

Objective To investigate the effect of LDHC protein on the invasion and metastasis of renal cell carcinoma. Methods Small interfering RNA mediated gene silencing approach was used to knockdown LDHC in renal cell carcinoma. The malignant characters of transfected Caki-1 cells including activities of invasion and metastasis were analyzed using millicell chamber assay. Western blot was used to quantify protein levels of LDHC and MMP-9. Lactic acid concentration in culture medium was measured. Results siRNA effectively inhibited LDHC protein levels (P<0.05). With siRNA interfering cells, the invasion and metastasis abilities of cells were depressed (P<0.05). Lactic acid concentration was decreased. The protein level of MMP-9 was reduced. Conclusions The expression of LDHC is associated with the function of RCC cells, whose invasion and metastasis abilities are depressed. The possible mechanism is that LDHC may enhance the expression of MMP-9 and increase the concentration of lactic acid in culture medium.

renal cell carcinoma; LDHC; siRNA; invasion; metastasis

2015-03-09

2015-05-22

李雙(1989-)，男(漢族)，在讀碩士研究生.研究方向：泌尿腫瘤. E-mail：doctorsli@163.com

R737.25

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.010.015