陳瑞琪,朱蘊(yùn)蘭,張 城,陳宏偉,李 敬

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院/江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心/江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室,江蘇徐州 221111)

富鍺金針菇菌絲體對(duì)小鼠耐疲勞能力的影響

陳瑞琪,朱蘊(yùn)蘭,張 城,陳宏偉*,李 敬

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院/江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心/江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室,江蘇徐州 221111)

以富鍺金針菇菌絲體為材料,將50只小鼠隨機(jī)分為5組:純空白組、空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組,并喂飼不同劑量的富鍺金針菇菌絲體,通過(guò)測(cè)定小鼠安靜時(shí)、運(yùn)動(dòng)后和運(yùn)動(dòng)休息后的血乳酸和血尿素氮含量及負(fù)重游泳力竭時(shí)間,探討富鍺金針菇菌絲體對(duì)小鼠抗疲勞能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:實(shí)驗(yàn)各劑量組富鍺金針菇菌絲體均可減少小鼠體內(nèi)血乳酸和尿素氮含量,延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間,且隨著劑量的增加小鼠抗疲勞能力增強(qiáng)。富鍺金針菇菌絲體在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)具有較好的抗疲勞能力。

金針菇,鍺,抗疲勞,乳酸,尿素氮,小鼠

金針菇(Flammulinavelutipes)學(xué)名毛柄金錢(qián)菌,又稱(chēng)毛柄小火菇、構(gòu)菌、樸菇、冬菇、樸菰、智力菇等,屬傘菌目口蘑科金錢(qián)菌屬真菌,世界各地均有分布,具有很高的藥用價(jià)值。金針菇通常生長(zhǎng)在柳、榆、白楊樹(shù)等闊葉樹(shù)的枯樹(shù)干及樹(shù)樁上。目前,金針菇已經(jīng)工廠化人工栽培,并成為人們備受青睞的食用菌之一。

金針菇不僅色、香、味俱全,而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,含有蛋白質(zhì)、多糖、黃酮、倍半萜、核苷酸、纖維素、維生素、微量元素等生物活性物質(zhì)。每100g干菇中含蛋白質(zhì)31.28g,纖維素3.34g,灰分7.58g,其氨基酸含量較高,每100g干品中氨基酸總量為17.28g,而能促進(jìn)兒童生長(zhǎng)發(fā)育的賴(lài)氨酸含量占全部氨基酸的6.3%。金針菇具有免疫調(diào)節(jié)功能、抗過(guò)敏作用和抗癌功效,金針菇在抗疲勞和消除疲勞方面有顯著作用,此外還可以降低膽固醇,經(jīng)常食用可以預(yù)防和治療肝臟疾病和消化道潰瘍等疾病[1-3]。

鍺屬于稀有元素,在植物、土壤中含量普遍較低,是人體必需的微量元素。人參、靈芝等的強(qiáng)身、滋補(bǔ)、抗癌作用,其中一個(gè)重要原因就是它們都含有鍺。另外,鍺在體內(nèi)不會(huì)發(fā)生積蓄,在47d內(nèi)會(huì)由腎、直腸以尿、糞形式排出[4-5]。

鍺化合物是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的新型抗癌藥,具有抗癌譜廣、毒性極低的優(yōu)點(diǎn)。此外,鍺可以清除體內(nèi)自由基,具有一定的抗氧化、抗衰老作用[6-7]。

食用菌具有較好的富集鍺的能力,富鍺食用菌的研究已有報(bào)道[8-12],但富鍺金針菇對(duì)機(jī)體耐疲勞能力的研究還尚未見(jiàn)報(bào)道,對(duì)富鍺金針菇菌絲體的耐疲勞功能進(jìn)行研究,對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)富鍺金針菇產(chǎn)品具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金針菇(Flammulinavelutipes) 本實(shí)驗(yàn)室保存;昆明小鼠 購(gòu)買(mǎi)于徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)20100003;富鍺金針菇菌絲體 本實(shí)驗(yàn)制備;蛋白胨,酵母汁 天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠,生物試劑;瓊脂粉 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司,生物試劑;葡萄糖 天津市紅巖化學(xué)試劑廠,分析純;硝酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純;過(guò)氧化氫 江蘇騰師化工廠,分析純;鍺標(biāo)準(zhǔn)液 國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn);血乳酸試劑盒,血尿素氮試劑盒 南京建成生物工程研究所。

HYG-Ⅱ回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動(dòng)化有限公司;GZX-DH40X45-BC電熱恒溫干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;FA-210N電子天平 上海精密儀器有限公司;YXQ-SG41-280手提式壓力蒸汽滅菌器 上海醫(yī)用核子設(shè)備廠;TAS-990MFG原子吸收分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;XT-9900智能微波消解儀 中國(guó)上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司;XT-9700冷卻機(jī) 中國(guó)上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司;XT-9800多用預(yù)防處理加熱儀 中國(guó)上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司;SIGMA3-30K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)sigma公司;TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基——SDAY培養(yǎng)基:葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母浸膏1%、瓊脂2%、去離子水;液體種子培養(yǎng)基——SDY培養(yǎng)基:葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母浸膏1%、鍺濃度500μg/mL、去離子水;液體擴(kuò)大培養(yǎng)基——同液體種子培養(yǎng)基。

1.2.2 菌種的活化及培養(yǎng) 活化后的菌種→斜面培養(yǎng)(25℃,5～7d)→搖瓶種子培養(yǎng)(500mL三角瓶裝樣量200mL,120r/min,25℃,5～7d)→擴(kuò)大培養(yǎng)(120r/min,25℃,5～7d)

1.2.3 菌絲體干粉的制備 將發(fā)酵液進(jìn)行抽慮得到菌絲體,將抽慮得到的菌絲體置于干燥箱中60～80℃干燥至恒重。將獲得的干燥菌絲體用粉碎機(jī)粉碎至無(wú)顆粒物出現(xiàn),裝入密閉的小塑料袋中,貼上標(biāo)簽,放入干燥器內(nèi)備用。

1.2.4 生物量的測(cè)定 將發(fā)酵液抽濾得到的菌絲體經(jīng)干燥后稱(chēng)量,即為生物量。

1.2.5 鍺元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確吸取1mL鍺標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶?jī)?nèi),加1%硝酸定容。分別取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0于1mL容量瓶中,加5μg基體改進(jìn)劑硝酸鎳,用1%硝酸定容,待測(cè)。

用TAS-990型火焰原子吸收分光光度計(jì)(波長(zhǎng)265.2nm,工作電流5mA,燃?xì)饬髁?000mL/min,燃燒高度5.0mm,負(fù)高壓350v,光譜帶寬0.4nm)測(cè)定其吸光度,以鍺濃度為橫坐標(biāo),以吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲,并求回歸方程。

1.2.6 菌絲體有機(jī)鍺含量的測(cè)定 菌絲體粉(三個(gè)平行)用透析袋MD44(8000-14000)透析2d,每天換2～3次水,將其中的無(wú)機(jī)鍺透析掉,透析后的樣品濃縮后微波消化。

微波消解:將透析濃縮后的樣品置入消解罐中,按1∶3的比例分別加入過(guò)氧化氫和硝酸,先進(jìn)行預(yù)熱,再放入微波消解儀中消解(微波消解階段設(shè)置:功率為80%,壓力為10kPa第一階段 時(shí)間300s),得到消解液于冷卻機(jī)中趕酸30min左右,再定容到10mL容量瓶中,待測(cè)。

鍺含量測(cè)定:同標(biāo)準(zhǔn)曲線鍺的測(cè)定。根據(jù)鍺標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算樣品中有機(jī)鍺的濃度,即為有機(jī)鍺含量。

1.2.7 有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率的計(jì)算方法

有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率(%)=菌絲體中有機(jī)鍺含量/培養(yǎng)基中總鍺含量×100

1.2.8 小鼠實(shí)驗(yàn)分組 將50只體重(20±2)g的雌性小鼠于實(shí)驗(yàn)室條件下適應(yīng)2d后稱(chēng)重。將全部小鼠隨機(jī)分為5組:純空白組、空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組,每組10只小鼠。純空白組自由喂養(yǎng),不灌胃任何東西;空白對(duì)照組按照每天每只37.5mg/kg·bw灌胃0.2mL正常培養(yǎng)的金針菇菌絲體粉水溶液;低劑量組按照每天每只37.5mg/kg·bw灌胃0.2mL富鍺金針菇菌絲體粉水溶液;中劑量組按照每天每只187.5mg/kg·bw灌胃0.2mL富鍺金針菇菌絲體粉水溶液;高劑量組按照每天每只375mg/kg·bw灌胃0.2mL富鍺金針菇菌絲體粉水溶液。各組每天灌胃一次,共灌胃15d。

1.2.9 小鼠血清乳酸(LD)和血尿素氮(BUN)含量測(cè)定 小鼠末次灌胃結(jié)束30min后,剪尾進(jìn)行第一次取血,此時(shí)為安靜時(shí)。處理好傷口后每只小鼠不負(fù)重,將其放入游泳缸中進(jìn)行游泳。游泳30min后取出,剪尾進(jìn)行第二次取血,此時(shí)為游泳后立即樣品。小鼠休息30min后剪尾進(jìn)行第三次取血,此為游泳休息后樣品。每次取血50μL。將取出的小鼠血液置于冷凍離心機(jī)(12000r/min,10min)中離心以分離出血清。再按照血乳酸試劑盒和血尿素氮試劑盒說(shuō)明方法測(cè)定小鼠血乳酸含量和血尿素氮含量。

表1 小鼠的血乳酸含量Table 1 The content of blood lactic acid in mice

注:不同英文大,小寫(xiě)字母分別表示顯著性差異程度(p<0.05,p<0.01);表2同。

表2 小鼠的血尿素氮含量Table 2 Blood urea nitrogen levels in mice

1.2.10 小鼠負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn) 小鼠在最后一次灌胃結(jié)束30min后,對(duì)其進(jìn)行稱(chēng)重。按照小鼠體重的5%在其尾根部纏繞鉛絲,使其負(fù)重。玻璃游泳缸中要保持水溫(30±2)℃,水深30cm。將小鼠置于玻璃游泳缸中游泳,記錄小鼠從開(kāi)始到沉入水面下5s不能上浮的時(shí)間。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理 用SPPS 13 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用LSD最小極差方法和Duncan新復(fù)極差進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 富鍺金針菇菌絲體有機(jī)鍺含量

經(jīng)測(cè)定和計(jì)算,鍺標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y=0.487x-0.001,R2=0.996。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程測(cè)得富鍺金針菇菌絲體有機(jī)鍺含量為452.8μg/g。

2.2 富鍺金針菇菌絲體對(duì)小鼠血乳酸含量的影響

喂飼小鼠不同的金針菇菌絲體后,測(cè)定小鼠不同運(yùn)動(dòng)時(shí)期的血乳酸含量,結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出,安靜時(shí)純空白組和空白對(duì)照組與富鍺各劑量組之間均存在顯著差異(p<0.05),純空白組與其它各劑量組之間存在極顯著差異(p<0.01),富鍺低劑量組與中、高劑量組之間存在極顯著差異(p<0.01),中高劑量組之間沒(méi)有顯著差異(p>0.05)。游泳后純空白組和空白對(duì)照組與其它各組都存在極顯著差異(p<0.01),純空白組與空白對(duì)照組之間也存在極顯著差異(p<0.01),富鍺低劑量組與高劑量組之間差異極顯著(p<0.01),低劑量組與中劑量組差異顯著(p<0.05),中劑量組與高劑量組差異不顯著(p>0.05)。游泳休息后純空白組和空白對(duì)照組與各劑量組都存在極顯著差異(p<0.01),富鍺低劑量組與高劑量組差異顯著(p<0.05),中劑量組與低、高劑量組均沒(méi)有顯著差異(p>0.05)。

金針菇菌絲體無(wú)論是富鍺還是不富鍺都具有減少小鼠血乳酸含量的能力,但富鍺金針菇菌絲體降低血乳酸含量的能力更強(qiáng),且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)有隨著鍺劑量增加而小鼠血乳酸含量減少的趨勢(shì)。

乳酸是機(jī)體糖無(wú)氧代謝產(chǎn)物之一,機(jī)體劇烈活動(dòng)時(shí)氧消耗過(guò)快,機(jī)體處于相對(duì)缺氧狀態(tài),糖酵解反應(yīng)加強(qiáng),產(chǎn)生大量乳酸,最終導(dǎo)致疲勞。乳酸在體內(nèi)的積累取決于乳酸的產(chǎn)生與消除速度。因此,減少乳酸的產(chǎn)生或加快乳酸的消除,都可延緩疲勞發(fā)生和加速疲勞的消除。

有機(jī)鍺對(duì)機(jī)體血液系統(tǒng)的作用可表現(xiàn)在增加紅細(xì)胞和血紅蛋白數(shù)量,有機(jī)鍺參與體內(nèi)氧的代謝,具有很強(qiáng)的氧化脫氫能力,鍺進(jìn)入機(jī)體后與血紅蛋白結(jié)合,保證細(xì)胞的有氧代謝。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知,富鍺金針菇菌絲體在實(shí)驗(yàn)用量范圍內(nèi)均可以使小鼠在安靜時(shí)、游泳后和游泳休息后血乳酸含量降低,這可能是由于鍺的增氧作用使小鼠肌肉在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后不至于嚴(yán)重缺氧而產(chǎn)生糖酵解作用,從而減少乳酸產(chǎn)生。此外,也可能是富鍺金針菇菌絲體可以加快乳酸的分解或轉(zhuǎn)化,使乳酸含量快速降低。

2.3 富鍺金針菇菌絲體對(duì)小鼠血尿素氮含量的影響

喂飼小鼠不同金針菇菌絲體后,測(cè)定小鼠不同運(yùn)動(dòng)時(shí)期的血尿素氮含量,結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出,小鼠在各種狀態(tài)時(shí)純空白組的血尿素氮含量與其它各劑量組均有極顯著差異(p<0.01),小鼠安靜時(shí)和游泳休息后空白對(duì)照組與中劑量組和高劑量組均有顯著差異(p<0.05),小鼠游泳后空白對(duì)照組與各劑量組均有顯著差異(p<0.05)。

由此可見(jiàn),金針菇菌絲體無(wú)論是富鍺還是不富鍺都具有減少小鼠血尿素氮含量的能力,但富鍺金針菇菌絲體減少小鼠血尿素氮的能力更強(qiáng),且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)有隨著鍺劑量增加而小鼠血尿素氮含量減少的趨勢(shì)。尤其在小鼠激烈運(yùn)動(dòng)后富鍺金針菇菌絲體降低血尿素氮的能力顯得更強(qiáng)。

血尿素氮是機(jī)體在代謝中分解蛋白所產(chǎn)生的,較長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)后,當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間不能通過(guò)糖、脂肪分解代謝而獲取足夠的能量時(shí),蛋白質(zhì)分解代謝加強(qiáng),在供能的同時(shí)脫氨轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩?最終血液尿素含量增加[13-14]。

鍺具有增加血氧含量,清除自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)的富鍺金針菇菌絲體能夠顯著減少血尿素氮含量,可能是由于鍺的增氧作用使機(jī)體更多的進(jìn)行有氧代謝而產(chǎn)生能力,從而使蛋白分解減少,血尿素氮含量降低。

表3 小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間Table 3 Exhaustive loaded-swimming time in mice

注:力竭時(shí)間為分,秒。a,A分別代表0.01和0.05顯著性水平下的多重比較分析差異。2.4 富鍺金針菇菌絲體對(duì)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的影響

喂飼小鼠不同的金針菇菌絲體后,測(cè)定小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間,結(jié)果如表3所示。

從表3中可以看出,純空白組與空白對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異(p>0.05),但是這兩組與富鍺各劑量組之間都存在極顯著差異(p<0.01),富鍺各劑量組之間也存在顯著差異(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示富鍺金針菇菌絲體能夠顯著延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重游泳力竭時(shí)間,增強(qiáng)小鼠的耐疲勞能力。在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)隨著劑量的增加小鼠力竭游泳時(shí)間延長(zhǎng)。已有研究表明,鍺是人體需要的微量元素之一,具有多種重要的生理功能,具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力和富集氧以及增強(qiáng)造血系統(tǒng)的功能[15]。富鍺金針菇菌絲體能夠增加小鼠的負(fù)重游泳力竭時(shí)間,可能是與鍺增加了小鼠機(jī)體的含氧量和血液循環(huán)能力有關(guān),這個(gè)問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

富鍺金針菇菌絲體在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)可以減少小鼠血乳酸含量、血尿素氮含量、增加負(fù)重游泳力竭時(shí)間,且隨著劑量的增加抗疲勞能力增強(qiáng)。富鍺金針菇菌絲體具有較好的抗疲勞能力。

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Effect of the mycelium ofFlammulinavelutipesgermanium riched to anti-fatigue ability of mice

CHEN Rui-qi,ZHU Yun-lan,ZHANG Cheng,CHEN Hong-wei*,LI Jing

(School of Food and Biology Engineering,Xuzhou Institute of Technology,Jiangsu Province Research Center of Food and Biology Process Engineering Technology,Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe,Xuzhou 221111,China)

Using the mycelium ofFlammulinavelutipesenriched of germanium as materials,50 mice were divided into 5 groups randomly:blank group,the blank control group,low dose group,middle dose group,high dose group,then the mice was fed with different dose of the mycelium ofF.velutipesenriched of germanium respectively. By detecting the content of blood lactic acid and the content of blood urea nitrogen of mice on the quiet,following exercise and after rest,the effect of the mycelium ofF.velutipesenriched of germanium on the ability of anti-fatigue ability of mice was explored. The experimental results showed that each dose experimental group of the mycelium ofF.velutipesenriched of germanium could reduce the contents of blood lactic acid and urea nitrogen of mice,and prolong the exhaustion time of loading swimming,and with the increase of the dose of the mycelium,the anti-fatigue ability of mice was enhanced. The mycelium ofF.velutipesenriched of germanium had good anti-fatigue ability within the tolerance range of experimental dose.

Flammulinavelutipes;germanium;anti-fatigue;blood lactate;blood urea nitrogen;mouse

2014-08-06

陳瑞琪(1991-),女,本科,研究方向：食品科學(xué)與工程。

*通訊作者:陳宏偉(1963-),男,博士,教授,研究方向：微生物資源開(kāi)發(fā)利用。

江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新項(xiàng)目資助(SCX2012016)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)11-0365-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.066