岳 黎, 姜 珊, 熊 偉, 梅 雪, 金幼虹

(南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院: *牙周科; **口腔預(yù)防科, 江西 南昌 330006)

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Ctip2在福爾馬林引起的大鼠急性頜面部炎性疼痛中的表達變化

岳 黎*, 姜 珊*, 熊 偉**, 梅 雪*, 金幼虹*

(南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院:*牙周科;**口腔預(yù)防科, 江西 南昌 330006)

目的: 探討Ctip2在口頜面部炎性疼痛中的作用。方法：取成年健康雌性SD大鼠132只，隨機分為3組; 空白對照組大鼠(n=12)不作任何處理，生理鹽水(n=60)和福爾馬林組(n=60)各大鼠分別在其左側(cè)上唇注射 50 μL生理鹽水(n=60)或等量25 mL/L 的福爾馬林。注射結(jié)束后立即觀察各組大鼠在45 min內(nèi)的疼痛行為，并分別于注射后30 min及1、2、3、4 h各時間點取各組大鼠的腦干延髓段組織(n=12)；然后分別采用免疫組化染色(n=4)、免疫熒光染色(n=4)以及RT-PCR(n=4)檢測各大鼠Vc核中Ctip2的表達情況。結(jié)果：①注射25 mL/L福爾馬林后的各大鼠均表現(xiàn)出典型的雙時相性疼痛反應(yīng)，生理鹽水對照組僅在注射初期出現(xiàn)自發(fā)性痛行為反應(yīng)，空白對照組無類似表現(xiàn); ②注射福爾馬林后30 min、1 h和2 h各時間點大鼠Vc核中的 Ctip2陽性顆粒數(shù)量均明顯增多，且分布集中、染色較深(P<0.05)；注射福爾馬林后30 min、1 h各時間點的熒光陽性顆粒均明顯增多(P<0.05)；注射福爾馬林后30 min時，其Vc核中Ctip2 mRNA表達水平即明顯升高，2 h時達到峰值(P<0.05)。結(jié)論： Ctip2參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)對炎性疼痛刺激的調(diào)節(jié)。

福爾馬林; 炎性疼痛; 轉(zhuǎn)錄因子Ctip2; 三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(11):659]

疼痛是一種與組織損傷相關(guān)的不愉快的主觀感受，是機體應(yīng)對傷害性刺激而產(chǎn)生的生理及心理因素相結(jié)合的復(fù)雜情感體驗。傳遞口頜面部傷害性信息的傳入神經(jīng)主要終止于三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核(Vc核)，Vc核不僅是參與口頜面部傷害信息傳導(dǎo)和敏化的重要部位，同時也是口頜面部感覺信息的初級傳入中樞。傷害性刺激作用于面部末梢神經(jīng)的傷害性感受器后，即會使其產(chǎn)生沖動，并將激活的信息經(jīng)過一系列神經(jīng)中轉(zhuǎn)核團傳遞到大腦皮層。

轉(zhuǎn)錄因子Ctip2 (Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor (COUP-TF)-interacting protein 2)是由Avram等[1]于2000年發(fā)現(xiàn)的被認為是基因表達的主要調(diào)節(jié)器之一，除參與調(diào)控牙釉質(zhì)[2-4]、顱面骨縫[5]、皮膚[6-7]、T細胞[8]和大腦[9-10]等不同組織的形成及發(fā)育外，同時還是牙齒、皮膚、免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)育過程中的關(guān)鍵基因。

本實驗通過在大鼠左上唇皮下注射25 mL/L福爾馬林液50 μL建立急性炎性疼痛模型，并分別采用免疫組化、免疫熒光染色和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT- PCR)等方法，動態(tài)觀察Ctip2基因在三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核中表達變化，以探索Ctip2基因在急性炎性疼痛中所扮演的角色。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要試劑

成年健康雌性SD大鼠(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物科學(xué)部提供)；兔抗Ctip2 (Abcam，英國)；SP-9001免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、山羊抗兔IgG、山羊抗兔FITC、山羊封閉血清、免疫組化一抗稀釋液(北京中杉金橋)；多聚甲醛(PFA)、水合氯醛(上海國藥集團)；福爾馬林(山東科源制藥)；β- actin、Ctip2引物(上海Invitrogen)；TRNzol、Trans DNA Marker Ⅰ、2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ThermoScientific，美國)；無核酶水(北京天根生化科技)； Triton X -100(Sigma，美國)；中性樹膠、蔗糖(重慶北碚化學(xué)試劑廠)；瓊脂糖(北京華美生物技術(shù))。

1.2 大鼠頜面部疼痛模型的建立及其疼痛行為觀察

取成年健康雌性SD大鼠132只(初始體質(zhì)量180～200 g)，從中隨機抽取12只不作任何處理，用于正常對照(A組)。所余120只分別置于30 cm × 30 cm × 30 cm的透明玻璃觀察箱內(nèi)，靜置1 h待其熟悉環(huán)境后,再將其隨機分為實驗組(B組)和對照組(C組)(n=60)；然后用微量注射器以快速進針的方式分別在B組各大鼠的左側(cè)上唇皮下組織內(nèi)注射25 mL/L福爾馬林50 μL，C組各大鼠分別注射等量生理鹽水。注射結(jié)束后，立即觀察各組大鼠在45 min內(nèi)的疼痛行為，并以3 min為單位，分別記錄其在各時間點內(nèi)用前爪或后爪抓擦注射部位的持續(xù)時間(s)。

1.3 取材

分別于建模后30 min及1、2、3、4 h各時間點，從B、C組中各隨機抽取12只大鼠連同A組的12只大鼠一起采用40 g/L多聚甲醛溶液心內(nèi)灌注法處死，并立即取其腦干延髓段組織。然后再將各組時間點的12只大鼠的腦組織段均分為3等份(每份4只大鼠)，其中2份分別用于免疫組化染色、免疫熒光染色。另1份用于實時熒光定量PCR(RT- PCR)檢測。

1.4 Ctip2在各組大鼠Vc核中表達變化的觀察

1.4.1 免疫組化染色、免疫熒光染色觀察

1.4.1.1 腦干組織切片的制備

分別取各組各時間點大鼠的腦干及延髓段組織，以延髓閂平面為基準制作頭向4 mm、尾向6 mm 的組織塊后，置 40 g/L多聚甲醛溶液4 ℃下進行固定。固定2 h后,再將各組織塊轉(zhuǎn)入4 ℃凍存的300 g/L蔗糖溶液中4 ℃下過夜；待其脫水、沉底后，分別進行橫向連續(xù)冰凍切片(片厚10 μm)。

1.4.1.2 免疫組化染色觀察

分別取各組組織切片，放置30 min平衡至室溫后用0.01 mol/L PBS搖床漂洗5 min×3次；滴加30 mL/L過氧化氫液室溫孵育7 min至無氣泡產(chǎn)生；滴加50 g/L BSA封閉液常溫下封閉1 h；滴加兔抗Ctip2(1 ∶800)一抗4 ℃過夜；滴加山羊抗兔IgG(二抗)室溫孵育20 min；滴加 SABC著色劑常溫孵育20 min，DAB顯色。以上每個步驟完成后均用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。取上述處理的所有切片，分別經(jīng)脫水、透明、中性樹脂封片后，用Leica光學(xué)顯微鏡進行觀察。分別在每張組織切片上確定Vc核后，再從每張切片中各隨機選取5個視野，用ImagePro Plus測定其免疫蛋白的光密度值。

1.4.1.3 免疫熒光染色觀察

分別取各組組織切片，放置30 min平衡至室溫后用0.01 mol/L PBS搖床漂洗5 min×3次；轉(zhuǎn)入3 g/L triton溶液中浸泡15 min，再次用 PBS搖床漂洗5 min×3次；滴加山羊封閉血清(1 ∶10)常溫下孵育1 h；滴加兔抗Ctip2(1 ∶800)一抗，4 ℃過夜； PBS 5 min×3次，滴加山羊抗兔FITC(二抗)，室溫孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次,Hoechst襯染、100 g/L甘油封片，熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。分別在每張組織切片上確定Vc核后，再從每張切片各隨機選取5個視野，用ImagePro Plus測定其免疫蛋白的光密度值。

1.4.2 RT- PCR檢測各組Vc核中Ctip2 mRNA的表達

1.4.2.1 引物設(shè)計

首先通過pubmed的基因數(shù)據(jù)庫查詢到大鼠的Ctip2 mRNA基因編碼序列為NC-005105.3，位于染色體的 6q32。然后委托Invitrogen公司利用primer 5.0軟件設(shè)計并合成相關(guān)引物，具體引物序列(表1)。

表1 PCR引物序列

1.4.2.2 RT- PCR

分別取各組各時間點大鼠的Vc核組織，用Trizol法提取其總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后以cDNA為模板，β- actin作為內(nèi)參照，用熒光定量PCR儀進行實時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94 ℃× 3 min→94 ℃×45 s, 56 ℃×45 s, 72 ℃×45 s，共32個循環(huán)→72 ℃×5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取10 μL擴增產(chǎn)物，用 15 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，并用ChemiDocXRS超高靈敏度化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行觀察和拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠疼痛行為反應(yīng)的比較

疼痛行為觀察結(jié)果顯示：在大鼠左上唇皮下注射50 μL福爾馬林(B組)后，所有大鼠均出現(xiàn)了典型性雙時相的疼痛行為反應(yīng)，即在注射福爾馬林后立即用前(或后)爪快速抓擦注射區(qū)的頜面部，持續(xù)時間約為3 min(稱為急性期)，此后(3～9 min時間段)相對平靜；9 min后又出現(xiàn)明顯而集中的抓擦面部的行為且持續(xù)到30 min(該時間段為第二期傷害性反應(yīng))；30～45 min時間段內(nèi)僅可見少量且短暫的抓擦行為反應(yīng)；而A、C組大鼠均無上述類似的表現(xiàn)，C組雖在注射后3 min時也可觀察到擦面行為，但屬于自然生理行為(圖1)。

*與生理鹽水組相比P<0.05

2.2 Ctip2在各組大鼠Vc核中表達的變化

2.2.1 免疫組化染色結(jié)果

免疫組化染色結(jié)果顯示，A、C組僅可見少量散在分布的Ctip2陽性顆粒，且顏色較淺(圖2a、b)；而B組在注射福爾馬林后各時間點的Ctip2陽性顆粒數(shù)量均較A、C組有所增多，且分布集中、染色較深(圖2c～g)。圖像分析顯示，C組的光密度值雖稍高于A組，但兩者無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；而B組注射福爾馬林后30 min、1 h、2 h 各時間點的光密度值均明顯高于A、C組(P<0.05)， 其中以30 min時的增高程度最大，此后逐漸降低；注射后3、4 h各時間點的光密度值分別與A、C組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

圖2 注射福爾馬林、生理鹽水后其Vc核的Ctip2免疫組化染色結(jié)果(×100)

圖3 各組Ctip2免疫陽性產(chǎn)物光密度值的比較

2.2.2 免疫熒光染色結(jié)果

免疫熒光染色結(jié)果與免疫組化染色結(jié)果基本一致，B組注射福爾馬林后各時間點的Ctip2熒光陽性顆粒數(shù)量均較A、C組有所增多(圖4)圖像。分析顯示，B組注射福爾馬林后30 min、1 h各時間點的光密度值均明顯高于A、C組(P<0.05)，其中以30 min時的增高程度最大，此后開始降低；注射后2、3、4 h各時間點的光密度值分別與A、C組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖5)。

2.2.3 RT- PCR檢測結(jié)果

RT- PCR檢測結(jié)果顯示，B組大鼠注射福爾馬林后30 min，其Vc核中的Ctip2 mRNA表達水平即開始增加，2 h時達到峰值，此后逐漸降低；注射福爾馬林后30 min、1 h、2 h各時間點分別與A、C組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖6～7)。

圖4 注射福爾馬林、生理鹽水后其Vc核Ctip2免疫熒光染色結(jié)果(×100)

圖5 各組Ctip2免疫陽性產(chǎn)物光密度值比較

M: Marker, 1～7分別為：空白對照組, 生理鹽水組, 福爾馬林注射后30 min、1 h、2 h、3 h、4 h

圖6 Vc核Ctip2 mRNA的PCR電泳圖

圖7 各組mRNA表達水平的比較

3 討論

疼痛是各種疾病最常見的癥狀，嚴重困擾著人們的日常生活。為了探討疼痛的治療方法，人們發(fā)明了福爾馬林致炎性疼痛的動物模型。

許多研究均發(fā)現(xiàn)，在大鼠的面部皮下注射福爾馬林后，可致其三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核中的c- fos和GFAP表達水平增加[11]。在野生型大鼠的皮下注射福爾馬林液后，其脊髓背角中的c- Fos表達水平上升，而絲氨酸消旋酶(Serine Racemase)的表達下降；與野生型小鼠相比，絲氨酸消旋酶敲除后的小鼠對福爾馬林激起的炎性痛更敏感[12]；因此，中樞神經(jīng)元的C- fos的表達水平常被作為頜面部炎性疼痛刺激程度的觀察指標[13]。

本實驗為探討Ctip2基因在炎性疼痛中所扮演的角色，首先采用福爾馬林皮下注射法建立了大鼠頜面部炎性疼痛模型；疼痛行為觀察結(jié)果顯示，注射福爾馬林后所有大鼠均出現(xiàn)了典型的雙時相疼痛行為學(xué)反應(yīng)，說明口腔頜面部炎癥性疼痛模型成功建立。

轉(zhuǎn)錄因子Ctip2 基因編碼C2H2 鋅指蛋白,屬于krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子。在人類位于14號染色體的長臂14q32 .31 位點上；在小鼠則位于12號染色體的52.0 cM位點[14]上。目前許多研究都著手于通過從生殖細胞內(nèi)敲除或從特定細胞內(nèi)刪除Ctip2基因，來探討其對牙齒[2]、顱面骨[6]、皮膚[15]、T細胞[16]和皮質(zhì)脊髓運動神經(jīng)元[17]等發(fā)育的影響，并已明確Ctip2是這些組織發(fā)育過程中相關(guān)基因表達的主要調(diào)節(jié)器之一。但Ctip2基因在急性炎性痛中的作用尚鮮有報道。

本實驗中免疫組化染色結(jié)果顯示，實驗組注射福爾馬林后30 min、1 h、2 h各時間點，其Ctip2陽性染色顆粒的數(shù)量均較正常對照組、生理鹽水對照組明顯增多，且分布集中、染色較深；免疫熒光染色結(jié)果顯示，實驗組注射福爾馬林后30 min、1 h組各時間點分別與生理鹽水對照組和正常對照組相比，其Ctip2熒光陽性顆粒明顯增多，而2 h后其陽性表達顆粒則減少至生理鹽水對照組的水平；RT- PCR檢測結(jié)果顯示，實驗組注射福爾馬林后30 min，其Vc核中的Ctip2 mRNA表達水平開始增加， 2 h時達到峰值，此后逐漸降低，實驗組各時間的Ctip2 mRNA表達水平分別與正常對照組和生理鹽水對照組相比，除3、4 h無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)外，其他各時間點均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

綜上所述，在大鼠上唇皮下注射福爾馬林后，其Vc核中的Ctip2基因表達水平呈現(xiàn)時間性動態(tài)變化，說明Ctip2可能參與了二級神經(jīng)元的興奮調(diào)節(jié)；同時也提示，Ctip2基因的表達變化可以作為頜面部炎性疼痛程度的觀察指標。但本實驗僅觀察了Ctip2的表達變化規(guī)律，其在炎性疼痛中的具體作用機制還有待進一步研究探索。

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Expression of Ctip2 in formalin- induced acute maxillofacial inflammatory pain in rats

YUE Li*, JIANG Shan, XIONG Wei, MEI Xue, JIN You- hong

(*Departmentofperiodontics,TheAffiliatedStomatologicalHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

AIM: To investigate the changes of Ctip2 expression in caudal subnucleus of the spinal trigeminal nucleus (Vc) in rats with formalin-induced orofacial pain . METHODS: 132 adult female SD rats were randomly divided into 3 groups. The rats in control group(n=12) received no injection, in formalin or saline group (n=60) were injected with 50 μL of 25 mL/L formalin or the same volume of 0.9% saline into the left upper lips, respectively. The behavior of the rats was observed for 45 minutes. Their Vc were taken at 30, 60, 120, 180 and 240 minutes after injection respectively, Citp 2 expression in Vc was examined by immunochemistry, immunofluorescence and RT- PCR. RESULTS: The rats scratched the injected sites after administration of formalin, but did not in saline or control groups. Ctip2 protein expression was significantly upregulated in the rats 30 min,1 h and 2 h after formalin injection. Ctip2 mRNA was remarkably increased and reached the peak 2 h after administration of formalin. CONCLUSION: Ctip2 participates in regulating inflammatory pain in central nerve system.

formalin; inflammatory pain; transcription factor Ctip2; caudal subnucleus of the spinal trigeminal nucleus

2015-06-22;

2015-09-29

江西省教育廳科技計劃課題(12003268)

岳 黎(1987-)，女，漢族，山東人。碩士 姜珊為共同第一作者

金幼虹, E-mail: yhjin3713@sina.com

R780.2

A

1005-2593(2015)11-0659-06

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.11.004