張麗娟 李倩 鄧海靜 張文麗 王小君 裴鑫 郝小惠 李治國楊方

在矽肺形成過程中，被激活的內(nèi)皮細(xì)胞、吞噬二氧化硅的肺泡巨噬細(xì)胞等可釋放大量的細(xì)胞因子（包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血小板源性生長(zhǎng)因子等）。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）在矽肺病患者血清中的含量明顯升高[1]。肌成纖維細(xì)胞是一種超微結(jié)構(gòu)和生理功能介于平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的高度分化型細(xì)胞，特異性表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），具有很強(qiáng)的分泌細(xì)胞外基質(zhì)及收縮的功能[2-3]。那么，PDGF能否通過誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞的分化而發(fā)揮促矽肺纖維化作用，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。這將是本研究將要探討的內(nèi)容之一。研究表明，PDGF受體-β（PDGFR-β）與配體PDGF結(jié)合后，可促使肌動(dòng)蛋白重排，發(fā)揮促有絲分裂、趨化等生理作用，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[4-5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil-forming protien kinase，ROCK）可通過控制細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的排列和細(xì)胞收縮調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、遷徙、增殖和凋亡，在器官纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[6-7]。以上研究結(jié)果提示ROCK通路可能在PDGF促進(jìn)矽肺纖維化過程中發(fā)揮著重要作用。因此本研究又進(jìn)一步探討了ROCK通路是否參與了PDGF誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞的分化過程從而在矽肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康成年雄性 Wistar大鼠40只，體重（180±10）g（北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司），于河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)（溫度20~26 ℃，濕度50%~70%，晝夜交替，自由飲食進(jìn)水）。

1.2 材料與試劑 標(biāo)準(zhǔn)α石英粉塵（中國疾病預(yù)防控制中心）；兔抗大鼠α-SMA、ROCK、phospho-PDGFR-β多克隆抗體（美國Epitomics公司）；小鼠抗大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原單克隆抗體（美國 Sigma公司）；兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗、DAB顯色試劑盒、BCIP/NBT顯色試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 矽肺動(dòng)物模型建立 將動(dòng)物隨機(jī)分為四組，每組10只，乙醚麻醉后采用非暴露式氣管插管，按照實(shí)驗(yàn)分組支氣管內(nèi)一次性灌注生理鹽水或濃度為50 g/L的生理鹽水SiO2混懸液。（1）模型對(duì)照4周組：支氣管內(nèi)灌注滅菌生理鹽水1.0 mL/只，腹腔內(nèi)埋入注入生理鹽水的微量藥物釋放泵，4周后處死；（2）模型對(duì)照8周組：同模型對(duì)照4周組處理后于8周后處死；（3）矽肺模型4周組：支氣管內(nèi)灌注SiO2混懸液1.0 mL/只，腹腔內(nèi)埋入注入生理鹽水的微量藥物釋放泵，4周后處死；（4）矽肺模型8周組：同矽肺模型4周組處理后于8周后處死。各組動(dòng)物腹主動(dòng)脈采血后處死取肺組織并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，右下葉肺組織經(jīng)多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋以備免疫組織化學(xué)染色，其余肺組織迅速凍于液氮中保存以備Western blot檢測(cè)[8]。

1.3.2 Western blot法檢測(cè)大鼠肺組織內(nèi)α-SMA、phospho-PDGFR-β、ROCK以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá) 按照文獻(xiàn)[9]的方法提取并測(cè)定蛋白濃度后，90 μg/孔上樣，SDSPAGE電泳并轉(zhuǎn)膜。采用5%的牛血清白蛋白37 ℃封閉1 h，一抗（phospho-PDGFR-β抗體、Ⅰ型、Ⅲ型膠原抗體1∶1 000稀釋；α-SMA抗體、ROCK抗體、GAPDH抗體1∶500稀釋），4 ℃孵育過夜；二抗（1：3 000稀釋）37 ℃孵育1 h；堿性磷酸酶顯色。用圖像掃描后以Image J軟件對(duì)蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行吸光度（A）值的定量分析，目的蛋白條帶A值經(jīng)內(nèi)參平衡后，以各組與模型對(duì)照4周組的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料均以（±s）形式描述，進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀 模型對(duì)照組雙肺表面光滑，呈粉紅色，彈性良好。矽肺模型組雙肺顏色蒼白，質(zhì)地變硬，雙肺表面可見散在灰白色結(jié)節(jié)，分布較均勻。矽肺模型4周組與模型對(duì)照組相比，雙肺體積增大。而矽肺模型8周組與矽肺模型對(duì)照4周組相比，雙肺體積縮小。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織注：A：模型對(duì)照4周組；B：模型對(duì)照8周組；C：矽肺模型4周組；D：矽肺模型8周組

2.2 phospho-PDGFR-β、ROCK、α-SMA蛋白在肺組織中表達(dá)的變化 與模型對(duì)照組比較，矽肺模型組phospho-PDGFR-β、ROCK、α-SMA蛋白表達(dá)增強(qiáng)，其中矽肺模型4周組phospho-PDGFR-β、ROCK、α-SMA蛋白表達(dá)分別為模型對(duì)照4周組的3.89倍、2.46倍和1.53倍，矽肺模型8周組phospho-PDGFR-β、ROCK蛋白表達(dá)強(qiáng)度分別為模型對(duì)照8周組的3.81倍、2.07倍和1.48倍，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖2。

2.3 肺組織內(nèi)Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá) 與模型對(duì)照組比較，矽肺模型組的Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)增強(qiáng)，其中矽肺模型4周組Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)灰度值（OD值）為分別為模型對(duì)照4周組的1.73倍1.99倍，矽肺模型8周組Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)強(qiáng)度分別為模型對(duì)照8周組的1.97倍和2.02 倍。見表1、圖2。

表1 大鼠肺組織內(nèi)phospho-PDGFR-β、Rock、α-SMA、Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)（x-±s）

3 討論

圖2 大鼠肺組織內(nèi)phospho-PDGFR-β、ROCK、α-SMA以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)

目前塵肺病是我國最嚴(yán)重的職業(yè)病，2013年塵肺病報(bào)告病例數(shù)占職業(yè)病報(bào)告總例數(shù)的87.72%，給國家、社會(huì)和群眾健康帶來了極大的危害[10-12]。然而，在塵肺病的治療方面，目前尚無特效方法。因此，探索塵肺病發(fā)病的分子機(jī)制以延緩或阻斷肺纖維化的發(fā)展進(jìn)程，仍具有重要的實(shí)際意義。在矽肺形成過程中，吞噬二氧化硅的肺泡巨噬細(xì)胞可釋放大量細(xì)胞因子（包括TGF-β，PDGF等），其中TGF-β/Smad促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast）轉(zhuǎn)化構(gòu)成了器官纖維化發(fā)病過程中一個(gè)較為明確的機(jī)制[13-15]。

本研究中，筆者對(duì)肺纖維化過程中另一重要的促纖維化因子-PDGF在矽肺纖維化中的中的作用及其機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的探討。研究中，筆者采用非暴露式氣管二氧化硅混懸液灌注法制備大鼠矽肺模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)矽肺模型組大鼠雙肺顏色蒼白，質(zhì)地變硬，雙肺表面可見散在灰白色結(jié)節(jié)。矽肺模4周組與模型對(duì)照組相比，雙肺體積增大。而矽肺模型8周組與矽肺模型對(duì)照4周組相比，雙肺體積縮小。表明灌注SiO2粉塵4周后，矽肺模型大鼠肺內(nèi)已經(jīng)形成明顯的硅結(jié)節(jié)伴有彌漫性間質(zhì)纖維化，染塵后8周，模型大鼠肺纖維化程度進(jìn)一步加重，這符合矽肺的發(fā)生、發(fā)展特征，表明大鼠矽肺模型制備成功。研究中筆者還進(jìn)一步觀察了phospho-PDGFR-β、ROCK、α-SMA以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白在矽肺模型大鼠肺組織中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)模型對(duì)照組比較，矽肺模型組phospho-PDGFR-β、ROCK蛋白表達(dá)增強(qiáng)的同時(shí)，α-SMA蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而肌成纖維細(xì)胞特異性表達(dá)α-SMA，提示PDGF/ROCK信號(hào)通路在肌成纖維細(xì)胞分化過程中可能發(fā)揮了重要作用。此外，與相應(yīng)模型對(duì)照組比較，矽肺模型組Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)也明顯增強(qiáng)，而Ⅰ型、Ⅲ型膠原是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，因此Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的增加也是肺纖維化的重要病理特征—細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的重要表現(xiàn)。以上研究結(jié)果提示，PDGF可能通過激活ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)大鼠肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)矽肺大鼠肺組織內(nèi)膠原的合成，從而在肺纖維化形成過程中發(fā)揮了重要作用。

肺纖維化是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程的結(jié)局，是復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)相互作用導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡被打破的結(jié)果，因此，對(duì)于PDGF/ROCK通路是否在促進(jìn)膠原合成的同時(shí)也影響了膠原的降解，以及不同的細(xì)胞因子在矽肺纖維化形成過程中的相互作用仍將需進(jìn)一步研究探討。

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