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        紫杉醇脂質(zhì)納米粒子對(duì)KB、SKOV3細(xì)胞作用的對(duì)比分析

        2015-05-05 01:30:26王宗站楊金霞周宓邢曉波
        關(guān)鍵詞:內(nèi)鈣紫杉醇抑制率

        王宗站 楊金霞 周宓 邢曉波

        紫杉醇(TAX)被廣泛用于乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤。紫杉醇水溶性差,將其溶于無(wú)水乙醇和聚氧乙基代蓖麻油的混合溶媒中,此溶媒容易導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)[1]。脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體,其制作簡(jiǎn)單、能降低藥物不良反應(yīng)的發(fā)生并容易實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向等治療的優(yōu)點(diǎn)[2]。紫杉醇脂質(zhì)納米粒子作用KB、SKOV3,探討其作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)證實(shí)。

        1 材料與方法

        1.1 材料 紫杉醇納米粒子(TAX-NLC,蘇州大學(xué),批號(hào):20080525),1640培養(yǎng)基(GIBCO公司),F(xiàn)luo-3(美國(guó)Molecular Probes公司),小牛血清(GIBCO公司),胎牛血清(GIBCO公司),Dapi(上海寶曼科技生物有限公司),MTT(上海勵(lì)瑞生物科技有限公司),Phellotin Tax-Red(美國(guó)Molecular Probes公司),TCP-SP型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司),人口腔上皮癌KB細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù)),人卵巢癌SKOV3細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù)),HERA CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Kedro公司)。

        1.2 細(xì)胞培養(yǎng) KB細(xì)胞以含15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng),SKOV3以含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng),培養(yǎng)箱CO2濃度設(shè)定為5%,溫度設(shè)定為37 ℃。

        1.3 方法

        1.3.1 TAX-NLC作用KB、SKOV3細(xì)胞后鈣濃度的變化 制備KB、SKOV3細(xì)胞懸液,接種在蓋玻片上;培養(yǎng)24 h后,PBS洗滌3次;放入4 μmol/L的Fluo-3負(fù)載液中,在常溫條件下避光培養(yǎng)40 min,PBS洗滌;放入激光共聚焦顯微鏡專用凹槽內(nèi),加入200 μL無(wú)血清1640培養(yǎng)基;對(duì)照組為200 μL無(wú)血清1640,實(shí)驗(yàn)組為終濃度是100 nmol/L的TAX-NLC 200μL,同時(shí)在電腦上標(biāo)記細(xì)胞,動(dòng)態(tài)觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化。

        1.3.2 TAX-NLC作用KB、SKOV3細(xì)胞對(duì)F-肌動(dòng)蛋白的影響 KB、SKOV3細(xì)胞接種在蓋玻片上,培養(yǎng)24 h,加入最終濃度為100 nmol/L的TAX-NLC,作用3 h,PBS洗滌細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS洗滌,以戊二醛固定30 min,PBS洗滌,加入1%的tritonX-100和1%的BSA放置30 min,PBS洗滌。再加入5 μg/mL的Taxax Red-x phallodin 100 μL避光培養(yǎng)30 min,PBS洗滌,加入2 μg/mL的Dapi 100 μL避光培養(yǎng)30 min。激光共聚焦顯微鏡下觀察KB、SKOV3細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白形態(tài)學(xué)變化。

        1.3.3 MTT法檢測(cè)TAX-NLC對(duì)KB、SKOV3細(xì)胞的抑制率 將KB、SKOV3細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔終體積為100 μL,設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h,每孔加入TAXNLC 10 μL,終濃度為100 nmol/L,對(duì)照組加入10 μL 1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)3 h,PBS洗滌細(xì)胞。加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h,上機(jī)測(cè)試前4 h加入10 μL 5 mg/mL的MTT,棄上清液,加入100 μL DMSO,震蕩10 min,在波長(zhǎng)為570 nm處測(cè)各孔OD值。每組重復(fù)3次。100 nmol/L TAX-NLC對(duì)KB、SKOV3細(xì)胞的抑制率為(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

        1.3.4 熒光顯微鏡下觀察TAX-NLC作用KB、SKOV3細(xì)胞誘導(dǎo)多核細(xì)胞 制備細(xì)胞懸液,接種到蓋玻片上,培養(yǎng)24 h后,加入終濃度為100 nmol/L的TAX-NLC,作用3 h后,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每組設(shè)3個(gè)平行樣本。PBS洗滌細(xì)胞,以2%的戊二醛在常溫下固定30 min,PBS洗滌,加入2 μg/mL的Dapi 100 μL在常溫下避光培養(yǎng)30 min,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化。每個(gè)樣品至少計(jì)數(shù)10個(gè)高倍鏡視野,計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以(±s)表示,采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化 對(duì)照組KB細(xì)胞、SKOV3細(xì)胞,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),細(xì)胞亮度也隨之逐漸增加,形態(tài)越來(lái)越清晰。100 nmol/L的TAX-NLC作用KB、SKOV3細(xì)胞后,細(xì)胞亮度也逐漸增加,細(xì)胞形態(tài)逐漸清晰,但其亮度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過對(duì)照組。Fluo-3可以與細(xì)胞內(nèi)游離鈣結(jié)合,細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加。100 nmol/LTAX-NLC作用后,KB 細(xì)胞熒光強(qiáng)度在60 min時(shí),達(dá)到最高值;SKOV3細(xì)胞在50 min時(shí),達(dá)到最高值。SKOV3細(xì)胞在開始時(shí)熒光強(qiáng)度就很高。對(duì)照組KB細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度去本底后最大值為12(圖1),實(shí)驗(yàn)組KB細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度去本底后最大值為68(圖2);對(duì)照組SKOV3細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度去本底后最大值為16(圖3),實(shí)驗(yàn)組SKOV3細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度去本底后最大值為38(圖4)。

        圖1 對(duì)照組去本底KB細(xì)胞熒光強(qiáng)度

        圖2 實(shí)驗(yàn)組KB細(xì)胞去本底熒光強(qiáng)度

        圖3 對(duì)照組SKOV3細(xì)胞去本底熒光強(qiáng)度

        圖4 實(shí)驗(yàn)組SKOV3細(xì)胞熒光強(qiáng)度

        2.2 激光共聚焦纖維鏡下觀察KB、SKOV3細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白的變化 藍(lán)色的為細(xì)胞核,紅色的F-肌動(dòng)蛋白,圖5、7為未加藥組KB、SKOV3細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白形態(tài)圖像,F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白以細(xì)胞核為中心往四周呈放射狀分布,條理清楚,結(jié)構(gòu)完整,呈絲狀排列。圖6、8是經(jīng)100 nmol/L的TAX-NLC作用后F-肌動(dòng)蛋白形態(tài)圖像,F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白集聚呈團(tuán)塊狀或點(diǎn)狀,條理不清楚,結(jié)構(gòu)不完整,排列紊亂。

        2.3 MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞抑制率 100 nmol/LTAX-NLC 24、48、72 h對(duì)KB細(xì)胞的抑制率高于對(duì)SKOV3細(xì)胞的抑制率(P<0.05)。見表1。

        表1 100 nmol/L TAX-NLC對(duì)KB、SKOV3細(xì)胞的抑制率(x-±s,n=3) %

        2.4 熒光顯微鏡下觀察TAX-NLC誘導(dǎo)KB、SKOV3細(xì)胞產(chǎn)生多核細(xì)胞 正常KB、SKOV3細(xì)胞基本很少能見到多核細(xì)胞,加藥后多核細(xì)胞數(shù)目明顯增多。100 nmol/L的TAX-NLC作用KB、SKOV3細(xì)胞后,多核細(xì)胞比例分別為(85.62±2.51)%,(56.22±3.14)。100 nmol/L TAX-NLC 誘導(dǎo)KB、SKOV3細(xì)胞產(chǎn)生的多核細(xì)胞數(shù)目相比較,KB細(xì)胞的數(shù)目明顯多于SKOV3細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖9~12。

        3 討論

        TAX是臨床上廣泛使用的一類抗腫瘤藥物,對(duì)卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、頭頸部腫瘤、前列腺癌等均有較好療效[3]。TAX-NLC是由TAX、硬脂酸、卵磷脂、膽固醇、玉米油、無(wú)水乙醇經(jīng)高壓乳勻合成的納米化脂質(zhì)藥物。劉圣活等[4]報(bào)道納米顆粒具有優(yōu)良的傳輸性能。TAX以脂質(zhì)納米粒為載體,可以將TAX載入腫瘤細(xì)胞內(nèi),更好地殺傷細(xì)胞。劉敏等[5]報(bào)道,TAX-NLC對(duì)KB細(xì)胞的殺傷作用優(yōu)于TAX,其作用機(jī)制可能是TAX-NLC更容易通過細(xì)胞膜,并在細(xì)胞中濃聚。

        圖5 正常KB細(xì)胞F-actin

        圖6 實(shí)驗(yàn)組KB細(xì)胞F-actin

        圖7 正常SKOV3細(xì)胞F-actin

        圖8 實(shí)驗(yàn)組SKOV3細(xì)胞F-actin

        圖9 正常KB細(xì)胞 ×1000(熒光顯微鏡)

        圖10 實(shí)驗(yàn)組KB細(xì)胞 ×1000(熒光顯微鏡)

        圖11 正常SKOV3細(xì)胞×1000(熒光顯微鏡)

        圖12 實(shí)驗(yàn)組SKOV3細(xì)胞×1000(熒光顯微鏡)

        紫杉醇的抗腫瘤作用靶點(diǎn)在微管上[6],通過抑制微管解聚,干擾有絲分裂紡錘體的組裝,染色體不能分離,使腫瘤細(xì)胞阻滯在G2、M期,最終達(dá)到抗腫瘤的目的[7-8]。高鵬[9]報(bào)道紫杉醇可以阻斷微管網(wǎng)的重建路徑,將癌細(xì)胞的分裂控制在G2/M階段,抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散。胞漿內(nèi)Ca2+可以調(diào)控微絲的構(gòu)架分布,低濃度時(shí)可阻斷微絲末端的延伸,高濃度時(shí)可將其切成片段。微管的組裝與解聚受到鈣離子濃度的影響,低濃度時(shí)促進(jìn)組裝,高濃度時(shí)促使其解聚,而微管的解聚也會(huì)促使胞外鈣離子向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng),進(jìn)而造成細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃聚[10]。本實(shí)驗(yàn)中,TAX-NLC作用KB、SKOV3細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速升高,隨后出現(xiàn)F-actin變性,聚集成點(diǎn)狀、團(tuán)塊狀,從而使細(xì)胞喪失功能,最后死亡。說(shuō)明胞內(nèi)Ca2+濃度增加在TAX-NLC的抗腫瘤機(jī)制方面發(fā)揮了重要作用。

        本實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)也輕微的逐漸升高,可能是由于激光的照射激發(fā)細(xì)胞外的鈣離子向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng),游離鈣與Fluo-3結(jié)合,從而顯示熒光強(qiáng)度增加。KB細(xì)胞對(duì)照組去本底后熒光強(qiáng)度最高值為12,SKOV3細(xì)胞對(duì)照組在相同時(shí)相點(diǎn)為11,相差不是太大。實(shí)驗(yàn)組KB細(xì)胞鈣離子濃度去本底后最大值為68,是細(xì)胞外鈣離子濃度的5.6倍;實(shí)驗(yàn)組SKOV3細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度去本底后最大值為38,是細(xì)胞外鈣離子濃度的3.4倍;而KB細(xì)胞的胞內(nèi)鈣離子濃度大約是SKOV3細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的1.7倍。TAXNLC可能是啟動(dòng)了某種機(jī)制,使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度升高,致使F-actin形態(tài)異常,功能障礙,進(jìn)而導(dǎo)致微絲功能喪失,最終細(xì)胞死亡。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高的原因,目前還不十分清楚。一方面可能是激光的照射導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)結(jié)合鈣的解離或者是細(xì)胞外鈣離子的內(nèi)流;另一方面可能是微管十分穩(wěn)定,不能解聚,反饋機(jī)制要求鈣離子濃度升高,促使微管解聚,進(jìn)而導(dǎo)致鈣離子濃度的升高。TAX-NLC作用后KB細(xì)胞鈣離子濃度比SKOV3的濃度高,可能KB細(xì)胞對(duì)TAX-NLC更敏感,也可能KB細(xì)胞惡性程度更高。SKOV3細(xì)胞開始時(shí)就有較高鈣離子濃度,而后又緩慢升高,而KB細(xì)胞的鈣濃度開始時(shí)就從較低水平逐漸的升高,說(shuō)明SKOV3細(xì)胞在加入TAX-NLC的即刻就有產(chǎn)生了大量的游離鈣,而KB細(xì)胞的游離鈣是通過TAX-NLC作用后逐漸釋放的。

        100 nmol/L的TAX-NLC對(duì)KB細(xì)胞的抑制率約為SKOV3細(xì)胞的1.5倍,與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化的結(jié)果基本是一致的,即抑制率與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度是密切相關(guān)聯(lián)的。TAX-NLC對(duì)KB細(xì)胞有較強(qiáng)的抗腫瘤作用,可能是因?yàn)樗鼘⒏嗟腡AX載入到細(xì)胞內(nèi)。TAX-NLC可能僅改變其劑型和跨膜的性能,而TAX本身的抗腫瘤特性并沒有發(fā)生改變。張麗等實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)[11],TAX與紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞抑制機(jī)制相似。

        正常培養(yǎng)細(xì)胞中ASG細(xì)胞很少會(huì)形成多核巨細(xì)胞,但TAX作用于ASG細(xì)胞后會(huì)形成大量多核巨細(xì)胞。多核瘤細(xì)胞的形成是細(xì)胞死亡前的特征性表現(xiàn)之一[12-13]。TAX作用于微管,阻止了紡錘絲的形成,細(xì)胞核可以正常的分裂,而細(xì)胞漿不能正常的分裂,進(jìn)而一個(gè)胞漿內(nèi)可見多個(gè)細(xì)胞核,形成多核細(xì)胞。曾春等[14]研究發(fā)現(xiàn)TAX作用骨肉瘤U-2OS細(xì)胞后,出現(xiàn)大量多核細(xì)胞,其數(shù)量隨藥物濃度及作用時(shí)間的增加而增加。本實(shí)驗(yàn)中,100 nmol/L的TAX-NLC對(duì)KB、SKOV3細(xì)胞作用后,產(chǎn)生大量的多核細(xì)胞,有的可見多核巨細(xì)胞,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,TAX-NLC誘導(dǎo)KB細(xì)胞產(chǎn)生的多核細(xì)胞比例約為SKOV3細(xì)胞的1.5倍,此結(jié)果與細(xì)胞抑制率、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度基本相一致。TAX-NLC作用KB、SKOV3細(xì)胞,使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高,導(dǎo)致F-actin功能障礙,進(jìn)而使細(xì)胞的微管系統(tǒng)的平衡遭到破壞,導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制,產(chǎn)生大量的多核細(xì)胞,最后細(xì)胞死亡。

        Shi-Mun等[15]研究認(rèn)為多核細(xì)胞的出現(xiàn)和細(xì)胞凋亡有一定的關(guān)系,表達(dá)突變型p53的細(xì)胞可以打亂細(xì)胞周期的阻滯,出現(xiàn)多核細(xì)胞,表達(dá)野生型p53的細(xì)胞出現(xiàn)有絲分裂的阻滯,在某些因素的影響下,出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。不依賴p53基因的細(xì)胞也可以產(chǎn)生多核細(xì)胞。成纖維細(xì)胞,在松胞素的作用下,細(xì)胞核正常分裂,而細(xì)胞質(zhì)失去正常分裂能力,形成的雙核細(xì)胞,而且還可以進(jìn)入下一個(gè)周期,并沒有出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。TAX-NLC作用KB、SKOV3細(xì)胞后,產(chǎn)生大量的多核細(xì)胞,其產(chǎn)生的原因可能與p53基因有一定的關(guān)系。

        TAX-NLC 與TAX具有相似的抗腫瘤機(jī)制,作用于微管系統(tǒng),使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加,使F-actin聚集成團(tuán)塊狀、點(diǎn)狀,微絲的功能受到影響,有的形成多核細(xì)胞,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。TAX-NLC改變了劑型,更利于用藥,療效更好,有著廣泛的應(yīng)用前景。

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