孫運(yùn)良 馬建霞 吳紅玉 金晶 李淑德

·短篇論著·

雷公藤內(nèi)酯醇抑制COX-2表達(dá)調(diào)控胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的實(shí)驗(yàn)研究

孫運(yùn)良 馬建霞 吳紅玉 金晶 李淑德

雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TPL)是從中國(guó)傳統(tǒng)中藥雷公藤中提取的有效成分。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TPL不僅具有抗炎、抗免疫反應(yīng)等多種藥理作用，還具有廣譜抗腫瘤作用，是一種多靶點(diǎn)的天然抗腫瘤藥物[1-4]。實(shí)驗(yàn)表明，TPL能抑制體外培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞增殖及胰腺癌動(dòng)物移植瘤的生長(zhǎng)[1]。環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)為一種誘導(dǎo)型酶，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，TPL不僅可通過抑制COX-2表達(dá)調(diào)控炎癥過程，還可通過下調(diào)COX-2表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移[2,6]。然而TPL是否也通過下調(diào)胰腺癌細(xì)胞COX-2的表達(dá)而抑制腫瘤生長(zhǎng)目前尚不清楚。本研究應(yīng)用TPL干預(yù)人胰腺癌PANC1細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的作用，探討其相關(guān)機(jī)制。

一、材料和方法

1．細(xì)胞增殖檢測(cè)：人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1為長(zhǎng)海醫(yī)院保存，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml。96孔板每孔加入100 μl細(xì)胞懸液培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后更換為無血清的DMEM培養(yǎng)液，并分別加入終濃度為20、40、80 ng/ml的TPL(Sigma公司，純度≥98.0%)繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。以不加TPL干預(yù)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以PBS作為空白對(duì)照。每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)到時(shí)間點(diǎn)后每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，上酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)各孔在波長(zhǎng)570 nm處的吸光值(A570值)。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)孔A570值/空白對(duì)照孔A570值)×100%。

2．細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105/孔接種于24孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，分別加入終濃度為20、40、80 ng/ml TPL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以不加TPL干預(yù)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。收集細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。Annexin V-FITC試劑盒購自晶美生物工程有限公司，按說明書操作。

3．細(xì)胞的遷移能力檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×105/孔接種于6孔板，培養(yǎng)至約90%融合狀態(tài)時(shí)棄去培養(yǎng)液，用10 μl的Eppendorf Tip在平板中間劃一條橫線，PBS沖洗3次，加入無血清的DMEM培養(yǎng)液。然后分別加入終濃度為20、40、80 ng/ml的TPL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以不加TPL干預(yù)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。按0、24 h取樣，測(cè)量劃痕的距離。細(xì)胞遷移率=[(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離]×%。

4．細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)：Transwell小室購自Coster公司。每個(gè)小室的聚碳酸酯膜上加50 μl用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋的Matrigel，待其充分聚合。Transwell下室加入600 μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，Transwell上室加入200 μl用無血清DMEM培養(yǎng)液制備的5×105/ml的細(xì)胞懸液，分別加入終濃度為20、40、80 ng/ml的TPL培養(yǎng)24 h，以不加TPL干預(yù)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)24 h 后取出Transwell小室，用棉簽拭去聚碳酸酯膜表面的Matrigel，PBS輕輕沖洗，晾干，然后用0.1%結(jié)晶紫染色膜10 min，去除多余結(jié)晶紫染液，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。每個(gè)干預(yù)濃度做3個(gè)小室。每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

5．細(xì)胞COX-2、Caspase-3、MMP-9蛋白表達(dá)檢測(cè)：取各組不同濃度TPL干預(yù)24 h的PANC1細(xì)胞，用RIPA裂解液制備細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)COX-2、Caspase-3、MMP-9蛋白表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參。兔抗人COX-2、Caspase-3抗體，山羊抗人MMP-9抗體均購自Santa Cruz公司。最后ECL顯影、膠片曝光、顯影、定影。用凝膠圖像軟件分析系統(tǒng)掃描膠片，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

二、結(jié)果

1．PANC1細(xì)胞增殖的變化：TPL呈時(shí)間及濃度依賴性抑制PANC1細(xì)胞的增殖(圖1)。

2．PANC1細(xì)胞凋亡的變化：陰性對(duì)照組及20、40、80 ng/ml TPL干預(yù)組的細(xì)胞凋亡率分別為(2.6±0.5)%、(4.7±1.0)%、(10.5±2.0)%、(21.1±4.2)%(圖2)。各干預(yù)組PANC1細(xì)胞的凋亡率均顯著高于陰性對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

3．PANC1細(xì)胞遷移力的變化：陰性對(duì)照組及20、40、80 ng/ml TPL干預(yù)組細(xì)胞遷移率分別為(79.3±8.2)%、(73.3±7.0)%、(51.0±6.2)%、(32.3±4.5)%(圖3)。40、80 ng/ml組均顯著低于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)，而20 ng/ml組與陰性對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05；與24 h組比較，bP<0.05

圖2 對(duì)照組(2A)及20、40、80 ng/ml TPL干預(yù)組(2B、2C、2D)PANC1凋亡細(xì)胞

4．PANC1細(xì)胞的侵襲力變化：陰性對(duì)照組及20、40、80 ng/ml TPL干預(yù)組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(23.2±4.0)、(46.0±6.2)、(37.2±5.6)、(31.5±4.8)個(gè)/200倍視野。各干預(yù)組穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著高于陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，但隨TPL濃度的增加穿膜細(xì)胞數(shù)減少(圖4)。

5．PANC1細(xì)胞COX-2、Caspase-3、MMP-9蛋白表達(dá)量的變化：隨著TPL濃度的增加， PANC1細(xì)胞COX-2、MMP-9蛋白表達(dá)量逐漸下降，而Caspase-3蛋白表達(dá)量逐漸增加(圖5)。

圖3 PANC1細(xì)胞的遷移能力(劃痕實(shí)驗(yàn) ×100)

圖4 對(duì)照組(4A)及20、40、80 ng/ml TPL干預(yù)組(4B、4C、4D)PANC1細(xì)胞的侵襲能力(Transwell小室 ×200)

圖5 對(duì)照組(1)及20、40、80 ng/ml TPL干預(yù)組(2、3、4)PANC1細(xì)胞COX-2、Caspase-3和MMP-9蛋白的表達(dá)

討論盡管已有大量的實(shí)驗(yàn)證明TPL具有抗腫瘤作用，但其確切機(jī)制尚有待于進(jìn)一步明確。COX-2作為一種誘導(dǎo)酶，生理狀態(tài)下在大多數(shù)組織中不表達(dá)或微量表達(dá)，但在炎癥等病理過程中表達(dá)增加。研究證實(shí)，COX-2在胰腺癌組織中高表達(dá)[7]，使用選擇性COX-2抑制劑或沉默COX-2基因后均能抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示COX-2在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要的作用[8-9]。本研究結(jié)果顯示，TPL抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)明顯抑制COX-2蛋白表達(dá)，表明COX-2是TPL抗胰腺癌的分子靶點(diǎn)之一。Johnson等[2]的研究也發(fā)現(xiàn)，TPL可通過抑制結(jié)腸癌COX-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是細(xì)胞凋亡過程中的主要效應(yīng)因子。研究顯示，Caspase-3是COX-2重要的下游分子；特異性COX-2抑制劑NS-398或塞來昔布均可上調(diào)Caspase-3表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[10-11]。本研究結(jié)果顯示，TPL呈濃度依賴性抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性抑制COX-2、促進(jìn)Caspase-3表達(dá)，提示TPL通過抑制COX-2表達(dá)，促進(jìn)Caspase-3表達(dá)，從而發(fā)揮抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

侵襲、遷移是胰腺癌的主要生物學(xué)行為，也是影響治療效果和預(yù)后的重要因素。Zhang等[12]的研究及本課題組前期研究[13]的結(jié)果表明，MMP-9在胰腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，其過度表達(dá)與腫瘤對(duì)周圍組織的侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，COX-2可誘導(dǎo)MMP-9的產(chǎn)生，特異性COX-2抑制劑下調(diào)MMP-9蛋白表達(dá)，表明MMP-9是COX-2促進(jìn)腫瘤侵襲和遷移的下游基因之一[14-15]。本研究結(jié)果顯示，TPL亦下調(diào)胰腺癌細(xì)胞MMP-9表達(dá)，抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

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(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.03.017

江蘇省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(Y201420)；連云港市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目(1242)

222100 連云港 ，江蘇省連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科(孫運(yùn)良)；上海復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化內(nèi)科(馬建霞)；第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科(吳紅玉、金晶、李淑德)

李淑德，Email：lishude57@126.com

2014-01-12)