王晗旭，胡文全，韓琨，李莉

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論著·臨床

王晗旭，胡文全，韓琨，李莉

目的 探討膿毒癥患者外周血CD+4CD+25CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)比率變化的特點(diǎn)及臨床意義。方法 選取膿毒癥患者40例(28d內(nèi)存活22例，死亡18例)為膿毒癥組，健康人群30例為健康對(duì)照組，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Treg水平，比較2組Treg水平的差異，以及膿毒癥組治療前后Treg水平的變化。結(jié)果 膿毒癥組患者外周靜脈血中Treg占CD+4T淋巴細(xì)胞的(8.26±0.34)%，高于健康對(duì)照組的(5.40±0.25)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；膿毒癥患者治療1周后Treg占CD+4T淋巴細(xì)胞的(7.65 ±0.65)%，低于治療前的(8.26±0.34)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；存活組(n=22)和死亡組(n=18)Treg占CD+4T淋巴細(xì)胞比率分別為(8.23±0.34)%和(8.30±0.35)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 膿毒癥患者外周血中Treg水平增高，提示調(diào)控Treg水平是治療膿毒癥的新方法。

CD127；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；膿毒癥；淋巴細(xì)胞；調(diào)控

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克及外科大手術(shù)合并感染后常見的并發(fā)癥，也是全身炎性反應(yīng)綜合征、多器官功能障礙綜合征、膿毒性休克最終導(dǎo)致多器官功能衰竭的主要誘因[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每10萬人口中就有300例膿毒癥患者，其中30%死于膿毒癥及其嚴(yán)重的并發(fā)癥，盡管大量實(shí)驗(yàn)性研究和臨床干預(yù)措施廣泛采用，膿毒癥的發(fā)病率和其相關(guān)疾病的病死率仍居高不下且具有增長(zhǎng)趨勢(shì)[2]，近年來，眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者在病程的某個(gè)時(shí)期處于免疫抑制狀態(tài)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者表現(xiàn)出遲發(fā)超敏反應(yīng)喪失、病原清除能力下降、易發(fā)生繼發(fā)感染等免疫抑制情況，這都將成為導(dǎo)致膿毒癥患者病情惡化和死亡的誘因[4，5]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)已被證實(shí)具有免疫功能及免疫抑制特性的細(xì)胞亞群。本研究采用流式細(xì)胞儀技術(shù)分析膿毒癥患者外周血Treg的比率，探討其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選取天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普外科病房和外科重癥加強(qiáng)護(hù)理病房(SICU)膿毒癥患者40例為膿毒癥組，男21例，女19例，年齡(48.1±8.8)歲，其診斷依據(jù)2008年華盛頓國(guó)際膿毒癥定義會(huì)議上由危重病醫(yī)學(xué)會(huì)(SCCM)、歐洲加強(qiáng)治療醫(yī)學(xué)會(huì)(ESICM)、美國(guó)胸科醫(yī)師協(xié)會(huì)(ACCP)、美國(guó)胸科學(xué)會(huì)(ATS)和外科感染學(xué)會(huì)(SIS)等學(xué)術(shù)團(tuán)體共同提出的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)。基礎(chǔ)?。褐匕Y肺炎16例，胃穿孔8例，腸瘺5例，導(dǎo)管相關(guān)性血液感染5例，急性壞死性胰腺炎4例，腸系膜血管栓塞1例，急性化膿性膽管炎1例。另隨機(jī)選取天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普外科工作人員15例、社會(huì)健康查體志愿者15例(正常人群)共30例作為健康對(duì)照組，男14例，女16例，年齡(45.6±9.4)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 儀器和試劑 日本高速低溫離心機(jī)(HATASHI，Japan)，流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，BD公司)，37℃ 孵化箱(HATASHI，Japan)，PE-Cy5標(biāo)記的鼠抗人CD4單克隆抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗人CD25單克隆抗體、PE標(biāo)記的鼠抗人CD127單克隆抗體(BDeBioscience公司，USA)，人類淋巴細(xì)胞分離液(北京市鼎國(guó)生物科技有限責(zé)任公司)，Hank's液及磷酸緩沖鹽溶液(PBS)自行配制。

1.3 觀測(cè)項(xiàng)目及方法

1.3.1 標(biāo)本采集： 膿毒癥組患者確診后第1天以及治療后第7天清晨，對(duì)照組1次性清晨空腹，從外周靜脈抽取血液2ml，EDTA抗凝。

1.3.2PBMC分離： 采用Ficoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)：于抗凝血2ml內(nèi)加入等體積的Hank's液進(jìn)行稀釋混勻，避光環(huán)境下，先后將4ml淋巴細(xì)胞分離液及稀釋樣本加入離心管內(nèi)，放入低速離心機(jī)內(nèi)離心，溫度25℃，2 000r/min離心20min，后將乳白色PBMC懸液層轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，加入2倍體積的PBS液重懸并漂洗，反復(fù)漂洗2次后，將最終PBMC樣本加入至1.5ml的離心管內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)至1×106/ml。

1.3.3 標(biāo)記抗體檢測(cè)Treg： 在每1ml樣本中各加入PE-Cy5標(biāo)記的鼠抗人CD4抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體和PE標(biāo)記的鼠抗人CD127抗體 20μl，混勻，37℃保溫箱避光孵育30min。

1.3.4 淋巴細(xì)胞檢測(cè)： 加入PBS液0.5ml后予流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)先根據(jù)前向角(FSC)和側(cè)向角(SSC)散射光信號(hào)，對(duì)淋巴細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門，每次獲取設(shè)門內(nèi)細(xì)胞104個(gè)以上并保存數(shù)據(jù)。見圖1。

圖1 淋巴細(xì)胞設(shè)門，檢測(cè)CD4陽性情況

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，治療前后顯著性采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

注：A.健康對(duì)照組；B.膿毒癥組(治療前)；C.膿毒癥存活組；D.膿毒癥死亡組

3 討 論

3.1Treg的臨床研究 20世紀(jì)70年代，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種具有免疫抑制性質(zhì)的T細(xì)胞——Treg。其所具備的免疫相關(guān)特性已成為免疫學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[6]，Treg所具有的免疫抑制特性使得其在自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)中具有廣泛的應(yīng)用前景[7]。其相關(guān)研究領(lǐng)域已涉及炎性腸病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)及腫瘤相關(guān)疾病等。Mclarnon[8]認(rèn)為IBD與免疫、遺傳、感染等多種因素相互作用有關(guān)，其中免疫因素起著關(guān)鍵作用，Treg的減少、表面分子表達(dá)的缺陷、抑制功能的受損,均與IBD的發(fā)生相關(guān)[8]。Schneidawind等[9]、Leveson-Gower等[10]先后研究顯示，Treg水平的減低在GVHD的發(fā)生過程中起重要作用。Mougiakakos等[11]、Adeegbe等[12]分別研究顯示Treg與腫瘤相關(guān)疾病關(guān)系密切，Oleinika等[13]對(duì)腫瘤免疫逃逸方面的研究顯示，部分腫瘤抗原為自身抗原，Treg有利于自身抗原耐受,通過去除組織特異性Treg使抗腫瘤作用得到增強(qiáng)。

1EsperAM,MartinGS.Extendinginternationalsepsisepidemiology:theimpactoforgandysfunction[J].CriticalCare,2009,13(1):1-3.

2MayrFB,YendeS,AngusDC.Epidemiologyofseveresepsis[J].Virulence,2014,5(1):4-11.

3 戴新貴,姚詠明,艾宇航. 膿毒癥大鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞凋亡對(duì)輔助性T細(xì)胞漂移的影響及血必凈注射液的干預(yù)作用[J]. 中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué),2009,21(3):135-138.

4SugithariniV,PremaA,Berla-ThangamE.Inflammatorymediatorsofsystemicinflammationinneonatalsepsis[J].InflammRes,2013,62(12):1025-1034.

5 安瑩波，杜鐵寬，劉瑛，等.血清降鈣素原在急診膿毒癥早期診斷中的意義[J].疑難病雜志,2013,12(7):510-512.

6JiangLN,YaoYM,ShengZY.TheroleofregulatoryTcellsinthepathogenesisofsepsisanditsclinicalimplication[J].JInterferonCytokineRes,2012,32(8):341-349.

7VignaliDA,CollisonLW,WorkmanCJ.HowregulatoryTcellswork[J].NatRevImmunol,2008,8(7):523-532.

8MclarnonA.IBD:regulatoryT-celltherapyisasafeandwell-toleratedpotentialapproachfortreatingrefractorycrohn'sdisease[J].NatRevGastroenterolHepatol,2012,9(10):559.

9SchneidawindD,PieriniA,NegrinRS.RegulatoryTcellsandnaturalkillerTcellsformodulationofGVHDfollowingallogeneichematopoieticcelltransplantation[J].Blood,2013,122(18):3116-3121.

11MougiakakosD,ChoudhuryA,LladserA,etal.RegulatoryTcellsincancer[J].AdvCancerRes, 2010,107:57-117.

12AdeegbeDO,NishikawaH.NaturalandinducedTregulatorycellsincancer[J].FrontImmunol,2013,4:190.

13OleinikaK,NibbsRJ,GrahamGJ,etal.Suppression,subversionandescape:theroleofregulatoryTcellsincancerprogression[J].ClinExpImmunol,2013,171(1):36-45.

14 陸俊杰,葛志軍,戴吉. 膿毒癥患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞變化及其臨床意義[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué),2013,25(4):242-243.

17PotekhinaAV,ProvatorovSI,SokolovVO,etal.CD4(+)CD25(high)CD127(low)regulatoryTcellsinpatientswithstableanginaandtheirdynamicsafterintracoronarysirolimus-elutingstentimplantation[J].HumImmunol,2011,72(7):553-557.

Study of CD+4CD+25CD127lowregulatory T cells for patients with sepsis

WANGHanxu*,HUWenquan,HANKun,LILi.*DepartmentofSurgery,TianjinDongliDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300300,China

HUWenquan,E-mail:huwq@126.com

Objective To investigate the characteristics and clinical significance of peripheral blood CD+4CD+25CD127lowregulation T cells (Treg) changes ratio in sepsis patients.Methods Select 40 cases with sepsis patients (28 d survived of 22 cases, death of 18 cases) as sepsis group, 30 cases of healthy population as control group, using flow cytometry to detect peripheral blood Treg level, compared the differences between the level of Treg in two groups, before and after treatment Treg level changes.Results Sepsis group’s peripheral blood Treg / CD+4T cell:(8.26±0.34)%,which was higher than the healthy control group (5.40±0.25) %, the difference was statistically significant (P<0.05);sepsispatientsafter1weekoftreatment,Treg/CD+4Tlymphocytes:(7.65±0.65)%,whichwaslowerthanbeforetreatmentof(8.26±0.34)%,andthedifferenceswerestatisticallysignificant(P<0.05);survivalgroup(n= 22)anddeathgroup(n=18)Treg/CD+4Tlymphocyteratiowere(8.23 ±0.34)%and(8.30±0.35)%respectively,thedifferencewasnotstatisticallysignificant(P>0.05).Conclusion Septic patients’ peripheral blood Treg levels is increased, revealed that regulating Treg level is a new method for treatment of sepsis.

CD127; Regulatory T cells; Sepsis; Lymphocyte; Regulation

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目(No.05YFJMJC14700)

300300 天津市東麗區(qū)中醫(yī)醫(yī)院外科(王晗旭)； 300052 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普外科(胡文全、韓琨、李莉)

胡文全，E-mail:huwq@126.com

2015-01-30)

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.07.016