摘要：目的 探討5-Aza-dC及TSA對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901 Runx3基因甲基化和表達(dá)水平的影響?方法 對(duì)5-Aza-dC及TSA單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行體外培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞的處理，分別提取細(xì)胞蛋白質(zhì)?RNA和DNA，通過甲基化特異性定量PCR法進(jìn)行Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測?結(jié)果 對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量與各組相對(duì)表達(dá)量相比具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），各組蛋白表達(dá)水平具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）?結(jié)論 5-Aza-dC和TSA兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有一定的協(xié)調(diào)作用，進(jìn)而改善胃癌治療效果?

關(guān)鍵詞：5-Aza-dC；人胃癌細(xì)胞株；SGC-7901 Runx3基因甲基化

【中圖分類號(hào)】R735.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1672-8602（2015）04-0555-01

胃癌是一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致我國人民死亡的主要病因，該疾病在我國的死亡率和發(fā)病率均明顯高出世界平均值?化療藥物治療和手術(shù)治療是胃癌患者首選的治療措施，然而，有相當(dāng)一部分患者確診時(shí)已經(jīng)為晚期，因而手術(shù)治療效果較差，化療藥物也僅僅對(duì)于部分患者有效，且會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)一定的不良反應(yīng)癥狀?醫(yī)學(xué)研究結(jié)果證實(shí)，DNA甲基化在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了重要作用，因此，抑癌基因異常甲基化狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)是一種較為有效的胃癌治療方法?本次醫(yī)學(xué)研究就對(duì)5-Aza-dC及TSA對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901 Runx3基因甲基化和表達(dá)水平的影響進(jìn)行了分析，現(xiàn)報(bào)道如下?

1 資料和方法

1.1 材料

本次醫(yī)學(xué)研究所用材料包括：北京中杉金橋公司生產(chǎn)的β-Actin一抗?二抗，博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Runx3兔抗人多克隆抗體，TAKARA公司提供的探針和引物，F(xiàn)ermentas公司生產(chǎn)的dNTP和Taq酶，Promega公司提供的RTPCR試劑盒，Invitrogen公司提供的RNA抽提試劑TRIzol，TAKARA公司提供的Real Time PCR試劑，GEPIGENTEK公司提供的DNA修飾試劑盒，TIANGEN公司提供的DNA提取試劑盒，GIBCO公司提供的RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清，安徽醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供的胃癌細(xì)胞?

1.2 方法

1.2.1 各組細(xì)胞中Runx3基因mRNA的表達(dá)

根據(jù)TRIzol試劑盒要求對(duì)各組細(xì)胞RNA進(jìn)行提取，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)反應(yīng)條件進(jìn)行5min的95 ℃預(yù)變性擴(kuò)增，分別在95 ℃ 30 s?52 ℃ 30 s?72 ℃中進(jìn)行35個(gè)30 s的擴(kuò)增循環(huán)，后用瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，通過Quantity One軟件進(jìn)行β-Actin基因和Runx3基因條帶灰度值的分析，進(jìn)行3次相同的實(shí)驗(yàn)，并對(duì)各組灰度值比值的mean±SD進(jìn)行計(jì)算，以此作為Runx3 mRNA表達(dá)水平的結(jié)果?

1.2.2 各組細(xì)胞中Runx3基因蛋白的表達(dá)

按方法提取各組細(xì)胞蛋白，通過BCA蛋白濃度測定試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測定，調(diào)節(jié)后的蛋白加上緩沖液煮沸5 min，保證其完全變性，通過15 V恒壓和15%SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行30min的半干轉(zhuǎn)膜，將凝膠上的蛋白置于PVDF膜上?在室溫下用脫脂奶粉50g/L進(jìn)行PVDF膜的1h封閉，加入一抗稀釋液，在4 ℃環(huán)境中過夜孵育，后使用TBST漂洗PVDF膜進(jìn)行4次8 min漂洗，加入二抗稀釋液，連續(xù)1h在37 ℃環(huán)境中孵育，最后使用TBST漂洗PVDF膜進(jìn)行4次8 min漂洗[1]?

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本次醫(yī)學(xué)研究通過SPSS17.0軟件分析和處理所得數(shù)據(jù)?計(jì)數(shù)資料通過X2檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料通過（x±s）方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和表示，其他數(shù)據(jù)資料通過單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，如果所得分析結(jié)果P<0.05，可以證實(shí)兩組數(shù)據(jù)資料對(duì)比具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[2]?

2 結(jié)果

設(shè)定對(duì)照組甲基化水平為1，則其余各組細(xì)胞加藥后，TSA組甲基化水平為0.63，5-Aza-d C組甲基化水平為0.7，TSA+5-Aza-d C組甲基化水平為0.37?各組細(xì)胞的Runx3基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量為：對(duì)照組（0.14±0.04），5-Aza-d C組（0.29±0.02），TSA組（0.28±0.03），TSA+5-Aza-d C組（0.45±0.02），對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量與各組相對(duì)表達(dá)量相比具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）?各組細(xì)胞中Runx3基因蛋白表達(dá)情況：對(duì)照組（0.09±0.02），TSA組（0.37±0.10），5-Aza-d C組（0.35±0.05），TSA+5-Aza-d C組（0.50±0.09），各組蛋白表達(dá)水平具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）?

3 討論

腫瘤學(xué)研究結(jié)果提出，基因表達(dá)遺傳學(xué)改變和遺傳基因缺陷是誘發(fā)惡性腫瘤的主要原因，缺失和突變等基因缺陷均會(huì)對(duì)編碼區(qū)功能和結(jié)構(gòu)造成破壞，表觀遺傳學(xué)會(huì)誘導(dǎo)組蛋白乙?；?去乙?；駾NA甲基化等自身化學(xué)修飾方式發(fā)生一定的改變，進(jìn)而達(dá)到DNA功能調(diào)控的作用[3]?mRNA表達(dá)水平結(jié)果證實(shí)，TSA和5-Aza-dC都會(huì)導(dǎo)致Runx3基因mRNA表達(dá)水平的增加，兩藥聯(lián)合應(yīng)用效果更加顯著，由此可見，Runx3 mRNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與其表達(dá)水平之間存在直接聯(lián)系，5-Aza-dC和TSA會(huì)對(duì)Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化狀態(tài)產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)作用，進(jìn)而形成Runx3基因的重新表達(dá)，并起到Runx3基因重新抑制癌癥基因的效果?Runx3基因蛋白表達(dá)水平證實(shí)，各加藥組m R NA表達(dá)水平越高，則蛋白表達(dá)水平也就越高，而這一結(jié)果也提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，并從蛋白表達(dá)水平的角度證實(shí)了5-Aza-dC和TSA的藥效以及兩藥聯(lián)合的協(xié)調(diào)作用?

參考文獻(xiàn)

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