摘要：目的 觀察鹿骨鈣對(duì)骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用并對(duì)其毒理穩(wěn)定性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。方法 采用DMEM（10%FBS）培養(yǎng)液體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞，MTT法檢測(cè)不同濃度鹿骨鈣溶液對(duì)鼠成骨細(xì)胞的增殖作用；選取健康小鼠20只，雌雄各半，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。結(jié)果 鹿骨鈣片作用于鼠成骨細(xì)胞72h后，在一定濃度范圍內(nèi)，OD值明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），可促進(jìn)骨細(xì)胞增殖；實(shí)驗(yàn)組小鼠口服鈣片的LD50值大于8500mg/kg。結(jié)論 鹿壽春堂鹿骨鈣是一種能夠促進(jìn)骨細(xì)胞增殖的無(wú)毒級(jí)物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：鹿春堂鹿骨鈣；骨細(xì)胞增殖；毒理穩(wěn)定性

隨著社會(huì)的發(fā)展，中老年人群中骨質(zhì)疏松癥的患者逐年增加，目前國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界越來(lái)越重視該病的防治工作[1]。鹿壽春堂鹿骨鈣以馬鹿骨為核心組方，主要成分包括骨膠原，必須氨基酸以及鈣、維生素D等，對(duì)于增加骨密度，防治骨質(zhì)疏松具有一定的療效。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)鹿骨鈣溶液對(duì)骨細(xì)胞增殖的影響，并擬采用小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)鹿壽春堂鹿骨鈣進(jìn)行初步毒理學(xué)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，希望為該產(chǎn)品在臨床效果以及安全性的研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1材料與儀器 鹿壽春堂鹿骨鈣片；MC3T3-E1成骨細(xì)胞；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibico公司；FBS購(gòu)自杭州四季清公司；健康小鼠購(gòu)自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司；；ZHJH-1214C型超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備廠；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自日本島津；其余所有試劑均為分析純水平。

1.2方法

1.2.1 MTT比色實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)瓶中MC3T3-E1成骨細(xì)胞用胰蛋白酶消化后離心，重懸，記數(shù)，稀釋后接種于96孔板中，置于37℃，5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，24h后粉碎鹿骨鈣片，用溫浴的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同濃度接種到96孔板中，使最終細(xì)胞培養(yǎng)液濃度為8000、4000、1000、400、150、75、10、5μg/ml，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，剩余樣品孔加入等量的培養(yǎng)基作為對(duì)照，將96孔板置于37℃，5%CO2恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。干預(yù)48h后，每孔加入10μlMTT溶液（5 mg/m1），37℃孵育4 h，終止培養(yǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇490nm波長(zhǎng)，測(cè)定96孔板各孔光吸收值（OD值）。

1.2.2小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，鹿骨鈣制劑低于8500mg/kg時(shí)，小鼠均未發(fā)生死亡，因此未測(cè)出LD50。故采用最大耐受量實(shí)驗(yàn)。取鹿骨鈣粉碎，用無(wú)菌水配成最大濃度為340mg/ml的混懸液。取小鼠20只，雌雄各半，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各10只，對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠禁食12h后，一次性按照體重標(biāo)準(zhǔn)25ml/kg給予灌胃，對(duì)照組小鼠禁食12h后，給予等量無(wú)菌水灌胃處理，灌胃后連續(xù)觀察14d，記錄小鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料用%表示，t檢驗(yàn)比較分析，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)骨細(xì)胞增殖結(jié)果 不同劑量鹿骨鈣片干預(yù)成骨細(xì)胞48h后測(cè)得的OD值見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹿壽春堂鹿骨鈣片溶液不同濃度對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖影響不同，8000、4000μg/ml的鹿骨鈣片溶液檢測(cè)到的OD值比對(duì)照組的低，且差異顯著（P<0.05），表明在這個(gè)濃度下成骨細(xì)胞增殖受到抑制。1000、400、150、75μg/ml的鹿骨鈣片溶液檢測(cè)到的OD值比對(duì)照組的高，并且隨鈣溶液濃度增加OD值增加（P<0.05），因此在這個(gè)濃度范圍內(nèi)鹿骨鈣片有促進(jìn)骨細(xì)胞增殖作用并且顯示了一定的濃度依賴性。10、5μg/ml的鹿骨鈣片溶液效果與對(duì)照組相比無(wú)差異（P>0.05），表明此濃度鈣片溶液對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用效果同細(xì)胞培養(yǎng)液。

2.2小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 小鼠以8500mg/kg劑量灌胃后，在連續(xù)的觀察周期中并未表現(xiàn)出中毒癥狀，也未出現(xiàn)死亡。第15d處死小鼠后分別解剖實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠，經(jīng)檢查，各主要臟器沒(méi)有出現(xiàn)明顯異常改變。因此，鹿壽春堂鹿骨鈣片屬于安全無(wú)毒物質(zhì)。

3 討論

骨質(zhì)疏松是以骨組織顯微結(jié)構(gòu)受損，骨礦成分和骨基質(zhì)等比例不斷減少，骨質(zhì)變薄，骨小梁數(shù)量減少，骨脆性增加和骨折危險(xiǎn)度升高的一種全身代謝障礙的疾病。臨床導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的原因很多，鈣的缺乏是被大家公認(rèn)的因素[2-3]。但隨著人們飲食習(xí)慣、生活習(xí)慣、周圍環(huán)境及情緒等因素影響，人們呢的體液大多數(shù)均趨于酸性。因此，酸性體質(zhì)是鈣質(zhì)流失、骨質(zhì)疏松的重要原因[4-5]。而臨床研究表明，成骨細(xì)胞增殖受到抑制是中老年人產(chǎn)生骨質(zhì)疏松癥的細(xì)胞學(xué)機(jī)制[3]之一，本次研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)表明，在一定濃度范圍內(nèi)，鹿壽春堂鹿骨鈣對(duì)于成骨細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，這表明，鹿壽春堂鹿骨鈣可能能夠通過(guò)刺激成骨細(xì)胞增殖，增加骨密度來(lái)達(dá)到防治骨質(zhì)疏松癥的效果[6]。另外，本實(shí)驗(yàn)表明鹿骨鈣片對(duì)小鼠的最大耐受劑量（LD50）大于8500mg/kg，且解剖實(shí)驗(yàn)表明該鈣片不能誘導(dǎo)小鼠主要臟器發(fā)生突變，屬于無(wú)毒級(jí)。因此，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹿壽春堂鹿骨鈣是一種安全的無(wú)毒級(jí)物質(zhì)，對(duì)于未來(lái)在臨床防治骨質(zhì)疏松癥上可能會(huì)有很好的效果。

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編輯/哈濤