摘 要：花色素苷是一類重要的天然色素物質(zhì)，是植物主要呈色物質(zhì)之一，并在人類健康保護方面發(fā)揮越來越重要的作用。同時，其含量高低不僅與遺傳基因與調(diào)控序列相關(guān)，還與外界溫度、濕度、光質(zhì)及栽培措施等因素息息相關(guān)。葡萄花色素苷是近年來花色素苷研究的熱點，該文重點闡述了影響葡萄花色素苷合成的內(nèi)在遺傳因素及外部環(huán)境因素的研究現(xiàn)狀，以期為葡萄優(yōu)質(zhì)早熟栽培研究提供有益的信息。

關(guān)鍵詞：葡萄 花色素苷 生物合成 遺傳因素 環(huán)境條件

中圖分類號：Q-3 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2015）01（b）-0089-04

花色素苷（anthocyanin）屬黃酮類化合物，是決定植物花瓣、果實和種皮顏色的主要物質(zhì)，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，存在于植物表皮細胞的液泡中，呈現(xiàn)橙色、紅色至藍色[1]?；ㄉ剀站哂卸喾N生物學功能，如表皮中的花色素苷可吸收紫外輻射，保護葉和莖的內(nèi)源組織免受紫外線的損傷；不同顏色的花瓣可吸引媒介昆蟲傳粉；花色素苷還具有抵御低溫和干旱的作用，這樣可以防止一些病蟲害侵襲?；ㄉ剀帐翘烊坏膹娮杂苫宄齽?，有抗氧化，預防心腦血管疾病與抗癌等多種保健功能。因為它是一種天然食用色素，來源廣泛，并且具有安全、無毒等優(yōu)點。據(jù)測定，花色素苷的抗氧化效果分別是維生素C和維生素E的20倍和50倍[2]。因此，花色素苷在保健食品、園藝、醫(yī)藥和等方面都有重要的應(yīng)用價值。

葡萄是果蔬栽培中經(jīng)濟效益最高的品種之一，在我國具有悠久的栽培歷史，據(jù)中國農(nóng)學會葡萄分會統(tǒng)計，我國2011年葡萄栽培面積已達55.2萬hm2，總產(chǎn)量達843萬噸[3]。葡萄的品質(zhì)包括外觀品質(zhì)與風味品質(zhì)，外觀品質(zhì)主要是果實顏色、大小、形狀等；風味品質(zhì)是指糖酸含量、香味物質(zhì)、可溶性固體物等等。而葡萄色澤則是人們比較葡萄品質(zhì)最直觀的指標之一。葡萄果皮顏色主要由所含花色素苷的成分和含量來決定[4，5]，在果皮最外3～4層細胞中所含的不同類型花色素苷使葡萄呈現(xiàn)綠色、紫色、紅色等色澤。

為了提高葡萄的食用品質(zhì)，人們近年來從調(diào)整栽培技術(shù)、調(diào)控光照、改善品種結(jié)構(gòu)、溫度、濕度等多方面對葡萄花色素苷的合成調(diào)控進行深入的研究，并且取得了一定的進展。本文從葡萄花色素苷合成的內(nèi)在遺傳因素與外界影響因素兩方面闡述了葡萄花色素苷生物合成調(diào)控的最新研究進展，為我國南方鮮食葡萄的早熟優(yōu)質(zhì)設(shè)施栽培技術(shù)提供參考。

1 內(nèi)在遺傳因素

植物花色素苷的生物合成主要是由植物次生代謝丙烷類途徑和類黃酮途徑所形成。植物花色素苷的合成被結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因制，并且具有特定的時空調(diào)節(jié)機制。結(jié)構(gòu)基因直接編碼花色素苷代謝生物合成的一系列酶類，人們已經(jīng)從葡萄中克隆了查爾酮合成酶 （chalcone synthase， CHS）、類黃烷酮-羥化酶（flavanone-3’-hydroxylase， F3’H）、查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase， CHI）、二氫黃酮醇還原酶（dihydroflavonol reductase， DFR）和尿苷二磷酸-葡萄糖-類黃酮-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（UDPglucose flavonoid-glucosyl transferase， UFGT）等結(jié)構(gòu)基因[6，7]。大部分的花色素苷合成相關(guān)類黃酮結(jié)構(gòu)基因與光協(xié)同調(diào)控或受光促進果實的色素形成，這些結(jié)構(gòu)基因編碼形成的酶屬于光調(diào)節(jié)酶，都以光敏色素為光受體[8]。

1.1 花色素苷的早期生物合成基因

因為丙二酸CoA縮合成查爾酮和CHS基因催化4-香豆酸CoA，形成的查爾酮提供了類黃酮的基本碳骨架，所以CHS是類黃酮和花色苷合成的關(guān)鍵酶。Goto-Yamamot等[9]對葡萄3個CHS同源基因CHS1、CHS2、CHS3進行了轉(zhuǎn)錄水平的研究，它們可以在不同的條件下進行轉(zhuǎn)錄和表達，表達產(chǎn)物不僅用于葡萄合成花色素苷或原花色素苷，也可用于其他酚類化合物的合成如CHS1和CHS2主要在白色品種果皮、幼葉和紅色品種的果皮中積累，而CHS3主要在紅色品種著色期間的果皮表達。這3種基因編碼的查爾酮合成酶很有可能分別用于3個不同的合成途徑，以便產(chǎn)生不同的次生代謝物。

CHI是首先被認識的黃酮類物質(zhì)合成相關(guān)酶，降低CHI的表達水平或者活性都會導致類黃酮生物合成途徑不能正常向下進行，花色苷等類黃酮物質(zhì)因此不能正常合成。CHI 對花青素的產(chǎn)生不是必需的，但完全缺少時會使突變體產(chǎn)生其他特殊顏色，CHI的參與可以確?；ㄉ照Ｋ降暮铣膳c相關(guān)器官正常顏色的形成。該基因最早是從菜豆、大豆中克隆得到的，后來又從矮牽牛中得到CHI2A與CHI2B基因。目前，已從紫花苜蓿、葡萄、金魚草、豌豆、海棠花等多種植物中分離克隆到了CHI基因[10-11]。

類黃烷酮3’-羥化酶（F3’H）催化4’，5，7-三羥基黃烷酮的C3位上羥基化形成二氫黃酮醇，是調(diào)控花色素苷合成途徑中形成類黃酮物質(zhì)的關(guān)鍵基因。類黃烷酮3’，5’-羥化酶（F3’5’H）催化類黃酮B環(huán)上3’、5’位的羥基化反應(yīng)。F3’H的反應(yīng)通常生成呈紅色的花青苷類，F(xiàn)3’5’H催化生成花翠素類呈藍色的花色素苷[2， 6]。

1.2 花色素苷的晚期生物合成基因

DFR基因最早從金魚草和玉米中分離克隆，這項研究證實了花色素苷的顯色作用受DFR基因的調(diào)控[6， 12]?，F(xiàn)已從葡萄、擬南芥、草莓、水稻、蘋果等植物中分離克隆出來DFR，DFR在不同品種間表現(xiàn)出空間專一性調(diào)控，在花瓣中表達與CHS和CHI相協(xié)調(diào)[6，13]。Petit等[14]在2007年研究出了歐亞葡萄品種中的DFR晶體結(jié)構(gòu)，并證實了底物結(jié)合部位和識別部位的存在。另外，人們還發(fā)現(xiàn)，白光、鈣和蔗糖可誘導葡萄漿果中DFR基因的表達，人們從克隆到編碼葡萄DFR（CAA72420.1）的基因啟動子中發(fā)現(xiàn)DFR啟動子的特定序列參與了編碼葡萄花色素苷等基因的表達。因此說紫外受體信號轉(zhuǎn)導通路可能參與DFR基因的誘導[15]。

研究指出，決定葡萄果皮花色素苷最關(guān)鍵的酶是UFGT（類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶）[6]，它是第一個使花色素苷轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定花色素苷苷的酶，并且能使果皮由無色轉(zhuǎn)為有色，從而最終決定合成花色素苷的品種。UFGT只在有色葡萄品種轉(zhuǎn)色期后的果皮中表達，在白色品種和果肉中不表達，轉(zhuǎn)色期為上調(diào)表達，表達方式是除UFGT以外的一類調(diào)節(jié)基因控制的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，另外一類在轉(zhuǎn)色期之后控制UFGT的表達[10]。如在紅色葡萄品種中，UFGT只在轉(zhuǎn)色期后才表達，調(diào)節(jié)葡萄成熟過程中果皮的顏色[16]。

1.3 調(diào)控基因在花色素苷合成過程中的作用

植物花色素苷的合成不僅受結(jié)構(gòu)基因的控制，還要受到調(diào)控基因的控制。目前R2R3-MYB 蛋白、bHLH蛋白和WD40 蛋白[6-7]這三類轉(zhuǎn)錄因子都參與到了花色素苷合成調(diào)控的當中。這些轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因啟動子中相應(yīng)的順式作用元件相互結(jié)合，調(diào)節(jié)花色素苷苷生物合成途徑中一個或多個基因表達。在這個過程中一般是由MYB 轉(zhuǎn)錄因子、bHLH 轉(zhuǎn)錄因子和WD40蛋白構(gòu)成一個蛋白復合體，直接調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄[6-7]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子含有保守的DNA結(jié)合區(qū)域（Myb結(jié)構(gòu)域），每個結(jié)構(gòu)域約由52 個氨基酸構(gòu)成[17]。葡萄花色素苷苷合成中苯丙烷類途徑的主要調(diào)控基因是R2R3-Myb家族，包括VvMYBA1-1、VvMYBA1-2、VvMYBA2、VvMYBA3、VvMYB3、VvMYB4、VvMYB5a、VvMYB5b、VvMYBPA1和VvMYBPA2等[6-7， 18-24]。在上述諸多轉(zhuǎn)錄因子中，VvmybA1被認為是決定啟動葡萄花色素苷基因合成的主要因子，從而影響葡萄果皮的顏色發(fā)育[26-27]bHLH類轉(zhuǎn)錄因子有兩個功能區(qū)域，一個是主要由疏水氨基酸組成的HLH區(qū)，負責與其他bHLH類轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體，bHLH蛋白二聚化后才能結(jié)合DNA[28]。另一個是由約18個親水的堿性氨基酸組成的DNA 結(jié)合區(qū)。最近，Hichri等[29]從葡萄中克隆到bHLH類轉(zhuǎn)錄因子VvMYC1，研究結(jié)果表明該轉(zhuǎn)錄因子是控制葡萄漿果花青素和原花青素合成的轉(zhuǎn)錄復合物的一個組成部分。

WD40重復蛋白具有β螺旋結(jié)構(gòu)。研究表明，異源表達WD40重復蛋白，可以跟其它蛋白配體作用并正常發(fā)揮他應(yīng)有的功能，酵母雙雜交技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，這些配體主要是bHLH和MYB轉(zhuǎn)錄因子[2]。目前，已有鑒定出多種WD40重復蛋白基因，如TTG1、紫蘇的PFWD和玉米的PAC1、矮牽牛的AN11、擬南芥等 [30-31]。但未見有葡萄編碼WD40重復蛋白基因的報道。

2 外界環(huán)境因素

與其他植物一樣，葡萄果皮花色素苷的合成與積累是一個非常復雜的過程，除受到其本身的遺傳因素外，還與其栽培的各種環(huán)境因素和農(nóng)藝措施相關(guān)，包括光、溫度、水分、激素、糖分、土壤條件及修剪方式等，其中最主要是光、溫度、水分、糖和激素[2， 6-8， 32-33]

2.1 光

在許多植物的果實中，光作為一種環(huán)境信號，通過對相關(guān)酶基因的直接或間接調(diào)控來影響花色素苷生物合成[34]。光按波長范圍可分為紅外線、可見光和紫外線，藍光會促進新合成的有機物中蛋白質(zhì)的積累，紅光促進碳水化合物的增加[35]。近年來，國內(nèi)外學者對光調(diào)控花色素苷合成的機理研究十分關(guān)注，包括光強、光質(zhì)和光周期等[6-8， 32-33]。但大多數(shù)研究僅局限在農(nóng)作物、花卉組織培養(yǎng)和蔬菜幼苗上，對葡萄等水果花色素苷合成影響的報道仍然很少。從目前的研究結(jié)果來看，光強和光質(zhì)會對葡萄果皮花色素苷積累產(chǎn)生一定的影響[6， 8， 33]。如Jeong等[36]和Chorti等[37]等研究認為，光線照射對葡萄果皮花色素苷濃度有一定的影響。遮光處理可在一定程度上減少VvmybA1、MYB12、MYBA1和MYB5a轉(zhuǎn)錄因子mRNA的積累，從而影響花色素苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達，如FLS4、CHS、LDOX、OMT、UFGT和F3’H；這些研究還發(fā)現(xiàn)，延長光照射的時間也會使葡萄果皮花色素苷的積累降低，合適的光照時間有利于葡萄花色素苷的積累，而不同葡萄品種之間對光照的需求也不盡相同，需通過試驗再確定適宜的光強。Kataoka等[38]研究發(fā)現(xiàn)，白光和/或紫外線處理會增加葡萄果皮花色素苷的積累。雷鳴等[39]在紅地球葡萄上的研究結(jié)果則表明，藍光、紫光、黃光可促進葡萄花色素苷的積累，而紅光、橙光、綠光、全遮光則抑制花色素苷的積累；黃光和紫光可顯著促進葡萄芍藥素糖苷的合成，而綠光、橙光、全遮光則抑制芍藥素糖苷的合成。

2.2 溫度

在玉米[40]、擬南芥[41]、矮牽牛[42]和葡萄（Vitis vinifera）[43]等的研究中發(fā)現(xiàn)，溫度是影響植物組織中花色素苷積累的另一個主要環(huán)境因子。低溫會誘導花色素苷合成相關(guān)基因的表達，使花色素苷含量升高，如使PAL、CHS、CHI和DFR基因的轉(zhuǎn)錄水平升高幾倍；而高溫卻能抑制基因的表達，使花色素苷含量降低。溫度對葡萄花色素苷合成的調(diào)控發(fā)生在它合成途徑的多步反應(yīng)中，如對ANS、F3H、CHS、DFR、和UFGT基因進行調(diào)控[44]。與此同時，隨著轉(zhuǎn)錄因子對溫度的響應(yīng)，花色素苷的最終積累量也會發(fā)生不同程度的變化。如溫度過高會降低葡萄果皮花色素苷的積累，在30 ℃或35 ℃條件下種植的葡萄中的總花色素苷含量顯著降低，僅為25 ℃條件下花色素苷含量的一半，主要原因在于高溫一方面會抑制花色素苷合成相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄，另一方面還加快了已合成花色素苷的降解[45-46]。從不同年度田間生產(chǎn)的葡萄果皮花色素苷積累數(shù)據(jù)來看，花色素苷含量較低的一般出現(xiàn)在氣溫較熱的年份，而積累較多的則出現(xiàn)在氣溫偏涼的年份[47-48]

2.3 水分

水分狀況是影響葡萄花色素苷合成的重要環(huán)境因素。在葡萄成熟過程中，水分虧缺條件可極大地促進葡萄果皮花色素苷的生物合成，從而增強花色素苷的積累。研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄成熟過程中遇到缺水的刺激，不僅能促進花色素苷合成相關(guān)基因，如CHS，F(xiàn)3’H和UFGT等的表達，還會增加花色素苷B環(huán)修改相關(guān)基因，包括F3'5'H和Omt的表達豐度，從而使羥基化和甲氧基化花色素苷得以在葡萄果皮中積累[49]。人們研究還發(fā)現(xiàn)，缺水也可能通過限制原花青素和黃酮醇合成與積累相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達導致花色素苷合成基因的早期表達[50]。最近研究表明，缺水條件會提高葡萄果皮中三羥基化花色素苷的比例，如錦葵色素和香豆素衍生物等[51-53]。

2.4 糖

已有研究證實，花色素苷在葡萄果實中的積累起始于轉(zhuǎn)色期，即糖積累初始期，兩者在合成初期出現(xiàn)很強的關(guān)聯(lián)性[54-56]。這與糖在葡萄等植物花色素苷合成過程中的功能是密切相關(guān)的。首先，糖是花色素苷的前體物質(zhì)，也是花色素苷結(jié)構(gòu)的一個組分；其次，糖還能通過特異的信號轉(zhuǎn)導途徑來調(diào)節(jié)花色素苷合成相關(guān)酶基因的表達，從而影響葡萄著色[6， 54-55]。如Vitrac等[57]在葡萄懸浮細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，糖通過己糖激酶信號途徑能促進CHS基因的表達從而增加葡萄果皮花色素苷的積累。Zheng等[58]則認為糖能增強F3’H的基因表達，從而促進葡萄果皮花色素苷的積累。浙江省農(nóng)科院吳江研究團隊采用設(shè)施條件與離體培養(yǎng)相結(jié)合的方法研究歐亞種葡萄紅地球果實花色素積累與糖的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，鼠李糖能夠顯著促進芍藥色素糖苷含量增加，而蔗糖則起抑制作用。半定量RT-PCR分析顯示，葡萄糖類黃酮轉(zhuǎn)移酶RGufgt基因（GenBank：DQ513314）在葡萄幼葉中表達，在綠果時不表達，直到果實轉(zhuǎn)熟著色后再開始表達，這個過程一直持續(xù)至果實成熟，這與花色素苷積累的過程完全一致[59]。當然，糖的調(diào)控作用不僅是簡單的代謝或者滲透壓調(diào)節(jié)，ABA、JA、乙烯等植物生長促進激素信號與糖信號可能存在潛在的聯(lián)系[6， 60]。

2.5 激素

植物激素對果實花色素苷方面的研究報道較多，它往往通過影響植物體內(nèi)的代謝過程和基因表達來影響花色素苷的合成和積累。早在上世紀80年代，就有報道稱ABA能提高葡萄皮中花色素苷的含量，進而改變葡萄的著色[61]。進一步的研究顯示，ABA能影響花色素合成結(jié)構(gòu)基因CHS、CHI、DFR、UFGT等及調(diào)節(jié)因子VvMYBPA1的表達[62]，并且在栽培過程中直接噴灑ABA可促進葡萄著色而對質(zhì)量和產(chǎn)量無任何負作用[63]。乙烯也可加快葡萄果皮的著色進程。El-Kereamy等[64]研究發(fā)現(xiàn)，乙烯利處理葡萄果實后可刺激CHS、F3’H、ANS、UFGT等花青素合成結(jié)構(gòu)基因的長時間表達，從而加快葡萄果皮的著色速度。在葡萄懸浮細胞中發(fā)現(xiàn)，茉莉酸可促進花色素苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因CHS和UFGT等的表達[65]；水楊酸能誘導葡萄果實中PAL酶，從而間接刺激花色素苷的合成[66]。此外，有關(guān)實驗還證實，2，4-D和NAA可抑制花色素苷合成相關(guān)基因CHS、F3’H、ANS、UFGT及調(diào)節(jié)因子VvMYBPA1的表達[36， 62]。

由此看出，不同環(huán)境因子可影響葡萄花青素生物合成中相關(guān)編碼基因的表達，從而影響葡萄果皮花色素苷的合成與積累。

3 展望

綜上所述，人們已對葡萄果皮花色素苷合成的調(diào)控機理做了較為深入的科學研究，并且克隆、鑒定出許多相關(guān)的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因。但仍有很多問題等待我們做進一步的研究與探討，如轉(zhuǎn)錄因子如何實現(xiàn)相互協(xié)調(diào)和作用；轉(zhuǎn)錄復合物如何實現(xiàn)對不同結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控；各種環(huán)境因子對花色素苷代謝的綜合影響機制還未完全揭示；其他類黃酮物質(zhì)如單寧酸、異黃酮、原花青素等的合成是否影響葡萄花色素苷合成等；另外，葡萄花色素苷合成后如何修飾、轉(zhuǎn)運也有待于進一步研究。隨著葡萄基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學和表型組學的不斷發(fā)展[67-69]，進一步闡明葡萄花色素苷合成與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對于豐富葡萄分子生物學、分子遺傳學研究及開展葡萄花色素苷的分子育種與葡萄優(yōu)質(zhì)早熟栽培具有重要理論和實際意義。

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