摘要：目的 就PED相關(guān)糞腸球菌生物膜中胞外DNA作用進(jìn)行研究。方法 選擇根管治療術(shù)失敗或者被診斷為頑固性根尖周炎的單根管牙，并且提取根管內(nèi)糞腸球菌，鑒定糞腸球菌，制備糞腸球菌菌液，配制核酸染液。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)24h后基本都沒(méi)有菌胞附著，而對(duì)照組卻出現(xiàn)了較為密集的成熟生物膜結(jié)構(gòu)。在PED相關(guān)糞腸球菌生物膜的形成過(guò)程中，胞外DNA會(huì)發(fā)揮出極為重要的作用。結(jié)論 胞外DNA能夠成為攻克PED相關(guān)糞腸球菌生物膜的新靶點(diǎn)，具有極為突出的作用效果。

關(guān)鍵詞：PED相關(guān)；糞腸球菌生物膜；胞外DNA；作用

根管生物膜的存在是導(dǎo)致根管治療術(shù)失敗，以及根尖感染性疾病、牙髓感染性疾病經(jīng)久不愈的主要原因，而糞腸球菌則是主要導(dǎo)致根管內(nèi)感染治療失敗的致病菌。生物膜會(huì)讓糞腸球菌長(zhǎng)期生存于高抗菌藥性、高堿性、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的惡劣環(huán)境中，并且還會(huì)出現(xiàn)再感染的問(wèn)題[1]。實(shí)驗(yàn)表明：PED相關(guān)糞腸球菌生物膜中胞外DNA作用極為有效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1菌株和試劑 糞腸球菌、BhI液體培養(yǎng)基、吖啶橙、ClED培養(yǎng)基、溴化已錠（EB）、DNASEI。

1.2方法

1.2.1提取根管內(nèi)糞腸球菌 選擇根管治療術(shù)失敗或者被診斷為頑固性根尖周炎的單根管牙。牙體髓室和表面用碘伏（20g/l）進(jìn)行消毒，在根管內(nèi)插入標(biāo)準(zhǔn)紙捻，在根尖孔處停留10s。然后將紙捻取出，立即浸入到移液管中（盛有琉基乙醇酸鹽轉(zhuǎn)送液，劑量為1.0ml），浸泡30min后送檢。再用漩渦振蕩器振蕩1min移液管，將全部樣本的劑量都調(diào)整到300μl，離心10min。再用PBS稀釋，震蕩混勻。在ClED鑒定培養(yǎng)基上接種50μl，放置在溫度為37℃的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)18h。

1.2.2鑒定糞腸球菌 細(xì)菌學(xué)鑒定：基于ClED鑒定培養(yǎng)基上菌落的顏色和形態(tài)來(lái)鑒定是否為糞腸球菌，假定直徑約0.5mm、顏色的黃色的菌落為糞腸球菌。

生化反應(yīng)：65g/l氯化鈉肉湯、膽汁七葉苷、阿拉伯糖、甘露醇均為陽(yáng)性；山梨糖、觸酶均為陰性。在BhI瓊脂培養(yǎng)基中接種菌株，保存溫度為-4℃。

1.2.3制備糞腸球菌菌液 將單菌從BhI瓊脂培養(yǎng)基（已分離純化）取出，在BhI液體培養(yǎng)基中接種，并且放置在設(shè)定溫度為37℃的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h，離心10min，離心速度為4000r/min。洗菌2次，再加入無(wú)菌的BhI液體培養(yǎng)基來(lái)配制成菌液（OD600=0.6）。取2ml菌液放置于試管中，基于NCClS標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)合理配制，在30min內(nèi)完成，將配制好的菌液接種。

1.2.4配制核酸染液 取1mg溴化已錠、1mg吖啶橙溶于PBS溶液（Ph值為7.0，劑量10ml），配制成儲(chǔ)備液（濃度為100μg/ml），等份混合EB儲(chǔ)備液及吖啶橙稀釋成工作液。

1.3 DNASEI對(duì)糞腸球菌生物膜形成的影響 將一個(gè)滅菌的蓋玻片（規(guī)格為20mm×20mm）放入細(xì)胞培養(yǎng)皿（直徑35mm）內(nèi)，取1ml無(wú)菌BhI培養(yǎng)液及1ml菌液混合后滴至蓋玻片表面。對(duì)照組加入2ml的BhI培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入2ml的DNASEI（濃度為100U/ml）。封閉方式選用封口膜，放入37℃恒溫箱常規(guī)培養(yǎng)。在培養(yǎng)24h再取出，將封口膜開啟，吸凈液體。為了能夠?qū)⒈砻娓∮渭?xì)菌去除，可再用1mlPBS洗滌2次，然后再將200μl核酸染液滴加到生物膜表面，然后黑暗室溫孵育2min以便進(jìn)行ClSm觀察。

1.4 DNASEI對(duì)自由生長(zhǎng)至不同時(shí)段的生物膜的影響 在6孔培養(yǎng)板中放入蓋玻片（規(guī)格為20mm×20mm），取1mlBhI培養(yǎng)液和1ml標(biāo)準(zhǔn)菌液進(jìn)行混合，而后滴至蓋玻片表面，封閉封口膜，37℃培養(yǎng)6個(gè)時(shí)段（分別是48h、36h、24h、18h、12h、6h）。

1.5定量分析紅綠熒光 生物膜全部區(qū)域的各個(gè)層面都用ClSm予以逐次掃描，對(duì)紅綠光面積進(jìn)行分別統(tǒng)計(jì)，進(jìn)而對(duì)生物膜活性予以計(jì)算。生物膜活性=綠熒光量/綠熒光量+紅熒光量。

2 結(jié)果

2.1 DNASEI對(duì)糞腸球菌生物膜形成的影響 實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)24h后基本都沒(méi)有菌胞附著，而對(duì)照組卻出現(xiàn)了較為密集的成熟生物膜結(jié)構(gòu)。

2.2 DNASEI對(duì)自由生長(zhǎng)至不同時(shí)段的生物膜的影響 根管內(nèi)糞腸球菌生物膜的生長(zhǎng)活性在各個(gè)階段都被DNASEI明顯降低，與對(duì)照組存在著較為明顯的差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），生物膜中胞外DNA隨著生物膜的生長(zhǎng)而增多；由此可見(jiàn)，在PED相關(guān)糞腸球菌生物膜的形成過(guò)程中，胞外DNA會(huì)發(fā)揮出極為重要的作用。

3 討論

本研究采用溴化已錠（EB）染色劑作為胞外DNA的染色劑，溴化已錠的靈敏性較高，在檢測(cè)DNA中常被使用。EB雖然不能將檢測(cè)DNA直接穿過(guò)，但是卻含有一個(gè)與堿基位置接近的平面基團(tuán)，使得DNA與染料結(jié)合，并呈現(xiàn)出較為明顯的熒光。共聚焦顯微技術(shù)既可定位細(xì)胞內(nèi)熒光，又能夠定量分析細(xì)胞內(nèi)熒光，，獲得分布在樣品不同部位的熒光強(qiáng)度數(shù)值及變化情況。

本研究對(duì)PED相關(guān)糞腸球菌生物膜中胞外DNA作用進(jìn)行探討過(guò)程中，利用了生物制劑DNaseI，DNaseI是一種特異性DNA水解酶。將DNaseI放置在培養(yǎng)皿中24h后，卻基本沒(méi)有菌落出現(xiàn)在玻片上，而24h生物膜卻出現(xiàn)在沒(méi)有放置DNaseI的玻片上，這充分說(shuō)明：胞外DNA與PED相關(guān)糞腸球菌生物膜的形成密切相關(guān)[2-3]。而實(shí)驗(yàn)表明：早期生物膜的繼續(xù)形成可被DNaseI成功抑制，能夠明顯分解已成熟的生物膜，這充分說(shuō)明：胞外DNA對(duì)PED相關(guān)糞腸球菌生物膜成熟后的擴(kuò)散增厚都有著極為重要的意義?？傊?，胞外DNA能夠成為攻克PED相關(guān)糞腸球菌生物膜的新靶點(diǎn)，具有極為突出的作用效果。

參考文獻(xiàn)：

[1]古麗莎，凌均棨.根管生物膜及其臨床控制的研究進(jìn)展[J].國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2006，33（5）：349-351.

[2]文靜，范兵.根管內(nèi)糞腸球菌感染的研究進(jìn)展[J].國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2007，34（1）：13-15.

[3]倪玉華，張建軍，孫寶貴.DNA酶Ⅰ的研究進(jìn)展[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志，2006，26（6）：531-535.編輯/金昊天