摘要：以提取溫度、提取時(shí)間、固液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)為考察因素，以單葉蔓荊（Vitex rotundifolia L.）總黃酮得率為考核指標(biāo)，應(yīng)用正交試驗(yàn)對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，單葉蔓荊中總黃酮的最佳提取工藝為提取溫度70 ℃、時(shí)間1 h、固液比1∶12（m∶V）、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。該提取工藝簡(jiǎn)單、高效，適用于單葉蔓荊的總黃酮提取。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)稳~蔓荊（Vitex rotundifolia L.）；總黃酮；正交試驗(yàn)；提取工藝

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）05-1163-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.034

Abstract： The technology of extracting total flavonoids from Vitex rotundifolia L. was optimized by orthogonal experiment with the content of total flavonoids as index. The results showed that the optimal conditions were the ratio of solid to liquid of 1∶12（m∶V）， 70% ethanol， 1 hour of reflux at 70 ℃. The technology is simple and rapid for extraction of total flavonoids from Vitex rotundifolia L..

Key words：Vitex rotundifolia L.；total flavonoids；orthogonal experiment；extraction technology

牡荊屬（Vitex L.）植物為馬鞭草科灌木或喬木，主要分布在熱帶及溫帶地區(qū)。在我國(guó)有14種，主要分布在長(zhǎng)江以南地區(qū)，在東北、華北、西北等地也有少量分布[1]。單葉蔓荊（Vitex rotundifolia L.）為牡荊屬馬鞭草科，辛苦微寒，具清利頭目、疏散風(fēng)熱等功效，民間常用于頭痛、眼痛、感冒等病癥的治療[2-7]。研究表明，單葉蔓荊的化學(xué)成分主要包括黃酮類、倍半萜、二萜類、三萜類、苯丙素類、甾類等物質(zhì)[3-7]，其中黃酮類化合物為其主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[5-11]。因此，研究單葉蔓荊中總黃酮的提取工藝具有重要意義。

本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)對(duì)單葉蔓荊提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)影響提取的各種因素及條件進(jìn)行了探討，旨在為單葉蔓荊的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

單葉蔓荊由煙臺(tái)益生堂藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院天然藥物實(shí)驗(yàn)室鑒定為單葉蔓荊。

1.2 儀器

U-190型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；JA5003B型電子天平、DHG-9053型真空干燥箱（上海精密儀器儀表有限公司）；THH-6型恒溫水浴鍋（上海喬躍電子有限公司）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵、RE-301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 試劑

蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），其他試劑均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 單葉蔓荊中總黃酮含量的測(cè)定

1）供試樣品溶液的制備。準(zhǔn)確稱取單葉蔓荊粗粉30 g，于1 000 mL燒瓶中，按要求加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液，加熱回流提取一定時(shí)間，過濾，減壓回收溶劑，干燥，稱重，得到單葉蔓荊干膏。精確稱取在不同提取條件下得到的單葉蔓荊干膏10 mg，于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解，定容后備用。

2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。精確稱取于120 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10 mg，于100 mL容量瓶中，加60%乙醇30 mL，水浴微熱使其完全溶解，放冷，60%乙醇定容至100 mL，制成0.100 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別精確吸取蘆丁對(duì)照溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分別加入25 mL容量瓶中，各加0.75 mL亞硝酸鈉溶液（50 mg/mL），搖勻，靜置10 min；再加入0.75 mL硝酸鋁溶液（100 mg/mL），搖勻，靜置10 min；再加10 mL氫氧化鈉溶液（40 mg/mL），60%乙醇定容，搖勻，靜置10 min。于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4）精密度試驗(yàn)。精確吸取2.0 mL蘆丁對(duì)照溶液于25 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，平行操作5次，測(cè)定該方法的精密度。

5）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取適量供試溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，于0、2、4、6、8 h分別測(cè)定其吸光度，測(cè)定該方法的穩(wěn)定性。

6）重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批藥材，按照以上方法制備供試樣品溶液，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制所述方法測(cè)定吸光度，平行操作5次，測(cè)定該方法的重復(fù)性。

7）回收率試驗(yàn)。精確吸取6份已知含量供試樣品溶液各0.5 mL，加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定其吸光度，計(jì)算單葉蔓荊總黃酮的含量。

供試樣品總黃酮含量測(cè)定：精確吸取5 mL供試樣品溶液于25 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)方法測(cè)定其吸光度，并代入回歸方程，計(jì)算單葉蔓荊總黃酮的含量。

1.4.2 正交試驗(yàn) 為尋找最佳的提取條件組合，在單因素試驗(yàn)結(jié)果[單因素最佳條件為提取次數(shù)3次、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間2 h、固液比1∶10（m∶V，下同）和乙醇體積分?jǐn)?shù)70%]的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇了主要影響提取效果的提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、固液比（C）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）作為考察因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，以總黃酮含量作為考核指標(biāo)，按照L9（34）正交設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素及水平見表1。

1.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用篩選后得到的最佳工藝，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次重復(fù)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定其吸光度，計(jì)算單葉蔓荊總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸分析，得到的回歸方程為A=0.057 0C-0.008 3（r=0.999 8）。結(jié)果表明，蘆丁在0.004～0.045 mg/mL濃度范圍與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)結(jié)果表明，該測(cè)定方法RSD=0.28%，表明其精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，該測(cè)定方法RSD=1.27%，表明在8 h內(nèi)測(cè)定供試樣品，其總黃酮含量基本穩(wěn)定。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，該測(cè)定方法RSD=1.52%，表明該方法具有良好的重復(fù)性?；厥章试囼?yàn)結(jié)果表明，單葉蔓荊總黃酮平均回收率為99.29%，RSD=1.35%，表明該方法可行。

2.2 單葉蔓荊總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 正交試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。結(jié)果表明，影響單葉蔓荊總黃酮提取的主次因素依次為A、D、C、B，即提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、提取時(shí)間。方差分析結(jié)果表明，因素A和D對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響，因素C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響。按照方差分析結(jié)果，只對(duì)有顯著影響因素選擇最佳水平，而試驗(yàn)結(jié)果影響不大的因素則按照實(shí)際需要選擇合適的水平。因此，單葉蔓荊總黃酮提取最佳工藝確定為提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1 h、固液比1∶12、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，即A3B1C3D2。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，單葉蔓荊總黃酮的含量分別為2.50、2.49、2.52 mg/g，平均含量為2.50 mg/g，RSD=0.63%（n=3），表明該工藝條件穩(wěn)定、可靠。

3 小結(jié)與討論

在前期單因素試驗(yàn)中，對(duì)單葉蔓荊總黃酮提取過程中粒度、提取溫度、提取時(shí)間、固液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素進(jìn)行篩選，結(jié)果單葉蔓荊粒度對(duì)提取效率的影響很小，因此選擇對(duì)提取效率有較大影響的提取溫度、提取時(shí)間、固液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)為考察因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)選其最佳提取條件。經(jīng)正交試驗(yàn)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)影響單葉蔓荊總黃酮提取主次因素依次為提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、提取時(shí)間。經(jīng)綜合分析各種因素，選定A3B1C3D2為單葉蔓荊總黃酮最佳的提取工藝，即提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1 h、固液比1∶12、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，按此條件提取，總黃酮含量達(dá)到2.50 mg/g，并通過驗(yàn)證試驗(yàn)表明該提取工藝穩(wěn)定、可靠。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李春正，蘇艷芳，靳先軍.牡荊屬植物化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J].中草藥，2005，36（6）：930-938.

[2] 徐月燦.蔓荊子提取物的有效成分研究及其含量測(cè)定[J].生命科學(xué)儀器，2008，6（7）：54-55.

[3] SHEN J K， DU H P， YANG M， et al. Casticin induces leukemic cell death through apoptosis and mitotic catastrophe[J]. Ann Hematol，2009， 88（8）：743-752.

[4] DENG Y. Bioactive constituents of two medicinal plants from indonesia[D]. Ohio： Ohio State University， 2010.

[5] ONO M， YAMAMOTO M， YANAKA T，et al. Ten new labdane-type diterpenes from the fruit of Vitex rotundifolia[J]. Chem Pharm Bull， 2001， 49（1）： 82-86.

[6] YOSHIOKA T， INOKUCHI T， FUJIOKA S，et al. Phenolic compounds and flavonoids as plant growth regulators from fruit and leaf of Vitex rotundifolia[J]. Z Naturforsch C， 2004， 59（7-8）：509-514.

[7] KAWAZOE K， YUTANI A， TAMEMOTO K， et al. Phenylnaphthalene compounds from the subterranean part of Vitex rotundifolia and their antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. J Nat Prod，2001， 64（5）： 588-591.

[8] LUECHA P， UMEHARA K， MIYASE T， et al. Antiestrogenic constituents of the Thai medicinal plants Capparis flavicans and Vitex glabrata[J]. J Nat Prod， 2009， 72（11）： 1954-1959.

[9] GUHA G， RAJKUMAR V， ASHOK， et al. Polyphenolic constituents of methanolic and aqueous extracts of Vitex negundo render protection to Hep3B cells against oxidative cytotoxicity[J]. Food Chem Toxicol，2010， 48（8-9）： 2133-2138.

[10] VILLEGAS G？魷MEZ C， MART？魱NEZ-V？魣ZQUEZ M， ESQUIVEL B， et al. Antifeedant activity of anticopalic acid isolated from Vitex hemsleyi[J]. Z Naturforsch C，2009， 64（7-8）： 502-508.

[11] ANANDAN R， JAYAKAR B， KARAR B， et al. Effect of ethanol extract of flowers of Vitex trifolia Linn. on CCl4 induced hepatic injury in rats[J]. J Pharm Sci，2009， 22（4）： 391-394.