摘要：以鐵棍山藥（Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun）為試材，采用分光光度法研究了其與褐變相關(guān)的山藥苯丙氨酸解氨酶（PAL）的特性以及不同抑制劑對(duì)PAL活力的影響。結(jié)果表明，在試驗(yàn)范圍內(nèi)鐵棍山藥PAL的最適pH為8.6，不耐堿，更不耐酸；最適溫度為50 ℃，有一定的高溫耐受性，即使在80 ℃條件下保溫30 min仍有約12%的活力殘存；L-半胱氨酸鹽酸鹽和檸檬酸對(duì)鐵棍山藥PAL活力具有明顯抑制作用，植酸對(duì)PAL的抑制作用不明顯，而氯化鈉能促進(jìn)PAL活力。為有效抑制PAL引起的鮮切鐵棍山藥片的褐變，應(yīng)在酸性（pH<2.0）、低溫（<20 ℃）或高溫（>80 ℃）條件下進(jìn)行山藥切片的加工和貯藏，鮮切片的無硫護(hù)色劑應(yīng)首選L-半胱氨酸鹽酸鹽，其次是檸檬酸。

關(guān)鍵詞：鐵棍山藥（Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun）；苯丙氨酸解氨酶（PAL）；特性；褐變抑制

中圖分類號(hào)：R282.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）05-1169-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.036

Abstract： Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun was used to study the characteristics of phenylalnine ammonialyase（PAL） related to fresh cut slices browning. The effects of inhibitors on PAL activity were studied. The results showed that in the test range， the optimal pH of PAL in D. opposita Thunb. cv. Tiegun was 8.6. It was not able to endure acid and alkali， especially the former. The optimum temperature was 50 ℃. There was a certain tolerance of high temperature. About 12% of PAL relative activities were still remained even if PAL was incubated at 80 ℃ for 30 min. L-cysteine hydrochloride and citric acid had significant inhibition effect on PAL activity. The inhibition effect of phytic acid on PAL was not obvious. NaCl promoted PAL activity. In order to inhibit fresh cut slices browning resulting from PAL， processing and storage should be made at the acidic conditions（pH<2.0）， with the lower temperature （<20 ℃） or higer temperature（>80 ℃）. L-cysteine hydrochloride was preferred as anti-browning reagent for fresh cut slices， the second was citric acid.

Key words： Dioscorea opposite Thunb. cv. Tiegun； phenylalanine ammonialyase（PAL）； characteristics； browning inhibition

懷山藥（Dioscorea opposita Thumb）是我國著名的“四大懷藥”之一，鐵棍山藥（Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun）是懷山藥中的一個(gè)優(yōu)良品種，具有很高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值，是滋補(bǔ)佳品[1]，深受人們喜愛。目前，國內(nèi)對(duì)鐵棍山藥的開發(fā)研究主要集中在深加工方面，將鐵棍山藥加工為飲片是一種防止塊莖腐爛變質(zhì)、延長貯藏期、提高產(chǎn)品附加值的有效途徑，但在加工過程中，鮮切片褐變與否是決定其品質(zhì)好壞的關(guān)鍵因素。研究表明，鐵棍山藥的褐變分為酶促褐變和非酶促褐變兩種，而酶促褐變的褐變度與鐵棍山藥多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）和苯丙氨酸解氨酶（Phenylalnine ammonialyase，PAL）活力呈正相關(guān)，其相關(guān)性大小為PPO>POD>PAL[2]，另有研究證明，PAL與酚的生成有關(guān)，表明了其與褐變的關(guān)系密切[3]。目前，對(duì)鐵棍山藥PPO[4，5]和POD[6]已經(jīng)有了較為透徹的研究，為了全面有效地控制酶促褐變，對(duì)鐵棍山藥PAL進(jìn)行深入全面的研究具有重要意義。

PAL是一種只存在于植物及微生物細(xì)胞內(nèi)的酶，它是連接生物初級(jí)代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶，也是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶[7]，且PAL的活力往往作為酚類褐變的指標(biāo)，它可通過催化植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物酚類物質(zhì)的產(chǎn)生而影響酶促褐變[8]。從2006年開始，河南師范大學(xué)四大懷藥研究室就鐵棍山藥切片防褐護(hù)色展開了系列研究。本研究對(duì)鐵棍山藥片的PAL特性及抑制劑對(duì)其活力的影響進(jìn)行分析，為全面有效抑制鮮切鐵棍山藥片的褐變提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試鐵棍山藥由河南省溫縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，收獲后挑選大小一致、粗細(xì)均勻、無創(chuàng)傷、無病蟲害的鐵棍山藥塊莖切分成2 mm左右的薄片，備用。

L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-抗壞血酸、氯化鈉、檸檬酸、EDTA-2Na、植酸均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 PAL活力測(cè)定 參照Koukol等[9]的方法，有所改進(jìn)。取0.6 g鐵棍山藥切片，加入3 mL 200 mmol/L 的硼酸緩沖液pH 8.7冰浴條件下充分研磨，然后于4 ℃，12 000 r/min下離心20 min，收集上清液并立即用于酶活測(cè)定。PAL酶活反應(yīng)體系為： 2 mL 200 mmol/L 的硼酸緩沖液pH 8.7、200 μL粗酶提取液和1 mL 2.0 mmol/L L-苯丙氨酸。將該反應(yīng)體系于30 ℃下保溫30 min后，測(cè)定其在290 nm波長處的吸光度。1個(gè)酶活力單位（U）定義為測(cè)定條件下每分鐘引起A290 nm變化0.01所需的酶量。

1.2.2 pH對(duì)鐵棍山藥PAL活力的影響

1）最適pH。配制0.1 mol/L pH分別為7.0、8.0、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2的硼酸緩沖液。建立反應(yīng)體系，以L-苯丙氨酸為底物，30 ℃水浴條件下分別測(cè)定PAL活力。

2）酸堿耐受性。將加入底物的酶液在0.1 mol/L pH為2的檸檬酸緩沖液和pH為8的硼酸緩沖液中，于30 ℃水浴依次保溫0、5、10、20、30、60 min后，測(cè)定PAL活力。

1.2.3 溫度對(duì)鐵棍山藥PAL活力的影響

1）最適溫度。以最適pH的硼酸緩沖液按活力測(cè)定方法建立反應(yīng)體系，分別于20、25、30、35、40、50、60、70、80、90 ℃下保溫30 min，然后立即加入酶液測(cè)定PAL活力。

2）溫度耐受性。將加入底物的酶液置于20、30、40、50、60、70、80 ℃水浴下分別保溫0、5、10、20、30 min，測(cè)定PAL活力。

1.2.4 抑制劑對(duì)PAL活力的影響 在反應(yīng)混合液中分別加入檸檬酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽、植酸、氯化鈉，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.25%、0.50%、1.00%、2.00%，在最適條件下測(cè)定PAL活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)鐵棍山藥PAL活力的影響

2.1.1 最適pH 由圖1-A可知，在pH 7.0～9.2范圍內(nèi)，鐵棍山藥PAL活力呈先升后降的變化趨勢(shì)，pH為8.6時(shí)，鐵棍山藥PAL活力達(dá)最大。因此，為了控制鐵棍山藥酶促褐變，應(yīng)避開pH 8.6的環(huán)境進(jìn)行鐵棍山藥切片的鮮切加工。

2.1.2 酸堿耐受性 由圖1-B可知，在pH 2的檸檬酸緩沖液和pH 8的硼酸緩沖液中，隨著保溫時(shí)間的延長，鐵棍山藥PAL活力先急速下降，然后緩慢升高。從整體上說，pH 8條件下的酶活力明顯高于pH 2條件下的酶活力，這與鐵棍山藥PAL活力最適pH較高的結(jié)果相一致。水浴保溫5 min時(shí)，pH 2和pH 8條件下，酶活力殘存都小于50%（圖1-B），pH 2時(shí)，酶活力下降的更多更快。說明PAL不耐酸堿，尤其不耐酸。因此，在進(jìn)行切片護(hù)色時(shí)，pH較低的護(hù)色液比堿性護(hù)色液更能抑制鐵棍山藥切片PAL的活力。

2.2 溫度對(duì)鐵棍山藥PAL活力的影響

2.2.1 最適溫度 不同溫度條件下鐵棍山藥PAL的活力變化見圖2-A。由圖2-A可以看出，鐵棍山藥PAL活力隨溫度變化呈現(xiàn)兩個(gè)階段。階段Ⅰ為0～50 ℃，PAL的活力隨溫度升高而升高；階段Ⅱ?yàn)?0～90 ℃，PAL活力隨溫度升高而降低，90 ℃時(shí)達(dá)到最小值。因此，PAL的最適溫度為50 ℃，在低溫（<20 ℃）或高溫（>80 ℃）條件下進(jìn)行鐵棍山藥切片的加工可以有效抑制PAL引起的酶促褐變的發(fā)生。

2.2.2 溫度耐受性 由圖2-B可知，在20～50 ℃范圍內(nèi)，保溫使鐵棍山藥PAL活力降低不明顯；20 ℃保溫30 min PAL活力無明顯降低，30 ℃和40 ℃保溫30 min活力僅降低了15個(gè)百分點(diǎn)左右，50 ℃保溫30 min活力降低了20個(gè)百分點(diǎn)；高于50 ℃之后，保溫使PAL活力迅速降低，但在60 ℃條件下保溫30 min，PAL仍有約45%的相對(duì)活力，即使在80 ℃條件下保溫30 min仍有約12%的相對(duì)活力殘存。以上說明，鐵棍山藥PAL對(duì)高溫有一定的耐受性，熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。

2.3 抑制劑對(duì)鐵棍山藥PAL活力的影響

由圖3可知，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%時(shí)，L-半胱氨酸鹽酸鹽、檸檬酸、植酸和氯化鈉對(duì)鐵棍山藥PAL活力均具有明顯的抑制作用。在0.25%～2.00%范圍內(nèi)，氯化鈉對(duì)PAL活力具有明顯的促進(jìn)作用，植酸對(duì)PAL活力沒有明顯作用，L-半胱氨酸鹽酸鹽和檸檬酸對(duì)PAL活力的抑制作用隨其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而加強(qiáng)。由此可知，L-半胱氨酸鹽酸鹽、檸檬酸均能有效控制鐵棍山藥鮮切片PAL的活力，尤其以L-半胱氨酸鹽酸鹽效果最佳。這說明抑制劑能夠達(dá)到有效抑制PAL引起的鐵棍山藥鮮切片褐變的目的。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，鐵棍山藥PAL反應(yīng)的最適pH為8.6；PAL的酸堿耐受性結(jié)果表明，pH為2的條件下酶活力普遍低于pH為8條件下的酶活力。這說明酸性護(hù)色液比堿性護(hù)色液更能抑制鐵棍山藥鮮切片PAL的活力。這與甘薯（pH 8.5～9.5）[10]、水稻（pH 9.2）[11]、小麥（pH 8.8）[11]、蘆筍（pH 8.8）[12]、茉莉葉片（pH 8.8）[13]PAL的最適pH相同，與江力等[14]對(duì)山藥PAL特性的研究中得到的兩個(gè)最適pH 8.0、8.8也大致相同。江力等[14]對(duì)山藥PAL的酸堿耐受性研究表明，保溫20 min內(nèi)，酸性條件下的PAL活力更高，這與本研究結(jié)果相反，但是隨保溫時(shí)間延長，堿性條件下的PAL活力更高，與本研究結(jié)果一致。

研究表明，不同植物PAL的最適溫度和對(duì)高溫的耐受能力不同。蘆筍PAL的最適溫度為60 ℃，且在60 ℃以上活力顯著降低[12]，茉莉葉片PAL的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，超過35 ℃其活力明顯下降[13]。本研究結(jié)果表明，鐵棍山藥PAL最適溫度為50 ℃，其活力在較低溫度（0～40 ℃）下保持較高水平，在較高溫度（50～80 ℃）下隨溫度升高活力下降。而江力等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃時(shí)山藥PAL活力最大，而且山藥PAL的反應(yīng)適宜溫度為35～55 ℃。出現(xiàn)這種差異可能與所選山藥品種有關(guān)。

抑制褐變的措施之一是運(yùn)用抗褐變劑抑制褐變相關(guān)的酶活。研究表明，抑制PAL酶活的抗褐變劑主要包括有機(jī)小分子和金屬離子兩大類，有機(jī)小分子包括肉桂酸、8-香豆酸、L-2-氨氧基-3-苯丙酸、2-氨氧基乙酸以及某些氨基酸如組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、氟苯丙氨酸等[11]。宛國偉等[15]研究表明，不同濃度的苯丙氨酸、肉桂酸和阿魏酸溶液對(duì)離體丹參根的PAL活力均有抑制作用。本研究結(jié)果表明，L-半胱氨酸鹽酸鹽對(duì)PAL的抑制作用最為明顯，其次是檸檬酸。植酸對(duì)PAL的抑制作用不明顯，其中L-半胱氨酸鹽酸鹽對(duì)PAL的抑制作用與江力等[14]的結(jié)果一致。金屬離子如Ag+、Co2+、Ca2+等均可抑制百合鱗莖PAL的活力，以Ag+的抑制作用最強(qiáng)；但一些金屬離子Mn2+、Fe2+、Cu2+、Fe3+可能作為輔基與酶蛋白相互結(jié)合對(duì)百合鱗莖PAL的活力有明顯的促進(jìn)作用；還有些離子對(duì)PAL活力的作用與濃度有關(guān)，如Na+隨著濃度的升高，對(duì)PAL的作用由抑制變?yōu)榇龠M(jìn)作用，Mg2+隨著濃度的升高對(duì)PAL的作用由促進(jìn)變?yōu)橐种芠16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，Na+濃度小于0.25%時(shí)，明顯抑制鐵棍山藥的PAL活力，但當(dāng)Na+濃度在0.25%～2.00%范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)PAL的活力具有明顯的促進(jìn)作用。

綜合以上分析可知，為了有效抑制PAL引起的鮮切鐵棍山藥片的褐變，應(yīng)在酸性（pH<2.0）、低溫（<20 ℃）或高溫（>80 ℃）條件下進(jìn)行山藥切片的加工和貯藏，鮮切的無硫護(hù)色劑應(yīng)首先選擇L-半胱氨酸鹽酸鹽，其次是檸檬酸。

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