摘要：對(duì)漆斑菌（Myrothecium sp. IMER1）菌株液體發(fā)酵產(chǎn)膽紅素氧化酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化。采用單因素試驗(yàn)篩選出最適碳源為葡萄糖，氮源為硝酸銨，pH為7，溫度為28 ℃和最有效促進(jìn)產(chǎn)酶的金屬離子為Cu2+。在此基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)對(duì)影響產(chǎn)酶因素的效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出具有顯著影響的3個(gè)因素葡萄糖、pH和溫度。用最陡爬坡路徑逼近最大產(chǎn)酶區(qū)域后，利用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)對(duì)顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，得出pH、溫度和葡萄糖分別為5.7、28 ℃、8 g/L時(shí)，優(yōu)化后液體發(fā)酵液中膽紅素氧化酶活力提高到0.627 U/mL，比未優(yōu)化前的酶活力0.214 U/mL提高了近2倍，結(jié)果表明單因素與響應(yīng)面結(jié)合法可優(yōu)化菌株IMER1液體發(fā)酵產(chǎn)膽紅素氧化酶的條件。

關(guān)鍵詞：膽紅素氧化酶；漆斑菌（Myrothecium sp. IMER1）；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：Q556 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）05-1150-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.031

Abstract：The fermentation conditions of producing bilirubin oxidase （BOX） by Myrothecium sp. IMER1 were optimized. The optimal carbon source glucose， nitrogen source NH4NO3， pH 7， 28 ℃ and metal ion Cu2+ were screened with single factorial experiments. Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of six factors related to BOX production. Three statistically significant factors including glucose， pH and temperature were selected. The path of steepest ascent was used to approach the optimal region of BOX production subsequently. The optimal combined concentration for maximum enzyme activity was further optimized by response surface methodology and determined as follows： 5.7，28 ℃， 8 g/L. The maximum enzyme activity was 0.627 U/mL. The optimization of culture conditions of IMER1 led to about 2 fold increase in BOX enzyme activity compared with initial result 0.214 U/mL， indicating that single factor in combination with response surface methodology was an effective method for optimizing BOX enzyme activity conditions by Myrothecium sp. IMER1.

Key words： bilirubin oxidase； Myrothecium sp. IMER1； Plackett-Burman design； response surface methodology

漆斑菌屬（Myrothecium）是一種無(wú)性型絲狀真菌，屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目瘤座孢科（Tuberculariaceae）。漆斑菌屬是產(chǎn)膽紅素氧化酶的主要真菌，工業(yè)上常用該屬菌株生產(chǎn)膽紅素氧化酶（Bilirubin oxidase， BOX）[1]。膽紅素氧化酶是一種含銅的多酚氧化酶， 能催化膽紅素氧化， 氧氣是其電子受體。反應(yīng)過(guò)程為膽紅素氧化酶催化膽紅素生成膽綠素， 后者可進(jìn)一步氧化最終生成無(wú)色化合物[2-4]。在臨床檢驗(yàn)中，常使用膽紅素氧化酶來(lái)測(cè)定血液中膽紅素的含量。相比較其他膽紅素測(cè)定方法，酶學(xué)方法具有特異性、靈敏度高和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床手工或自動(dòng)化檢測(cè)[5，6]。近年來(lái)，由于膽紅素氧化酶的底物范圍廣和氧化能力強(qiáng)， 目前已被用于生物電池的制造、 污水處理等方面的研究[7-11]。

響應(yīng)面法是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過(guò)試驗(yàn)得到的一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法。該方法在優(yōu)化研究中應(yīng)用頻繁，是降低開發(fā)成本、優(yōu)化加工條件、提高產(chǎn)品質(zhì)量、解決生產(chǎn)過(guò)程中實(shí)際問(wèn)題的一種有效方法，已廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化學(xué)、制造等領(lǐng)域[12]。為了提高漆斑菌產(chǎn)BOX的能力，使其產(chǎn)酶量達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的需求，本試驗(yàn)對(duì)漆斑菌菌株Myrothecium sp.IMER1在液體培養(yǎng)體系中發(fā)酵產(chǎn)酶的影響因子進(jìn)行了研究和優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試漆斑菌IMER1，從武漢植物園土壤中分離得到；2，2-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸銨）（ABTS），美國(guó)SIGMA公司；馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB）：20%馬鈴薯（削片煮水）+2%葡萄糖。

紫外可見分光光度儀（UNICO-UV-2000型），上海尤尼柯儀器有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16/TGL16型），湖南湘儀集團(tuán)；全溫氣浴振蕩搖床（ZD-88型），金壇市成輝儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 液體培養(yǎng) IMER1菌株斜面培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基中，26～27 ℃靜置，通常5～7 d可產(chǎn)生大量的分生孢子，用適量的蒸餾水將試管中的孢子沖洗出來(lái)，通過(guò)顯微計(jì)數(shù)，將孢子數(shù)量調(diào)整到1×108 個(gè)/mL，使用前將孢子懸浮液搖勻。用移液槍吸取不同量孢子液注射入滅菌后的培養(yǎng)基中。將接種的培養(yǎng)基放在搖床中，150 r/min下振蕩培養(yǎng)，根據(jù)需要調(diào)整培養(yǎng)液的起始pH和培養(yǎng)溫度。菌株IMER1在液體基質(zhì)中培養(yǎng)一段時(shí)間后， 將菌絲過(guò)濾即得到粗酶液。

1.2.2 酶活測(cè)定 酶活測(cè)定采用ABTS法，參考文獻(xiàn)[13]。在3 mL反應(yīng)體系中，含有2.7 mL pH 4.5的0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液、0.1 mL酶液、0.2 mL 1 mmol/L ABTS，按次序混合并搖勻，30 s后開始記錄A420 nm，每隔15 s記錄一個(gè)A420 nm值。一個(gè)酶活力單位（U）：在上述條件下，每分鐘催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 篩選漆斑菌IMER1培養(yǎng)的最適碳源、氮源、pH、溫度和金屬離子。①碳源。采用不同碳源木糖、甘露糖、蔗糖、葡萄糖、微晶纖維素添加到培養(yǎng)基中，測(cè)定菌株IMER1產(chǎn)BOX的相對(duì)酶活；②氮源。采用有機(jī)氮源（蛋白胨、尿素、酵母浸膏）和無(wú)機(jī)氮源（硝酸銨、硫酸銨）添加到培養(yǎng)基中，測(cè)定菌株IMER1產(chǎn)BOX的相對(duì)酶活；③pH。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基使其處于不同的pH（4、5、6、7、8、9、10、11），測(cè)定菌株IMER1產(chǎn)BOX的相對(duì)酶活；④溫度。在不同的溫度下培養(yǎng)（22、28、32、37 ℃）， 測(cè)定菌株IMER1產(chǎn)BOX的相對(duì)酶活；⑤金屬離子。在培養(yǎng)基中添加不同金屬離子（Na+、K+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、 Fe3+、 Co2+）， 測(cè)定菌株IMER1產(chǎn)BOX的相對(duì)酶活。

1.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS？誖8.0軟件中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)程序進(jìn)行響應(yīng)面分析，并利用該軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同碳源和氮源的影響 如圖1所示，在對(duì)照培養(yǎng)基中，菌株IMER1生長(zhǎng)良好，但產(chǎn)酶量不大；在加入蔗糖和葡萄糖的培養(yǎng)基中，BOX產(chǎn)量是對(duì)照的2.5倍；在加入微晶纖維素的培養(yǎng)基中，菌株IMER1生長(zhǎng)慢，但BOX產(chǎn)量是對(duì)照的2倍左右；在加入木糖和甘露糖的培養(yǎng)基中，菌株IMER1生長(zhǎng)速度一般，BOX產(chǎn)量比較低。結(jié)果表明，在對(duì)照培養(yǎng)基中，由于缺乏速效碳源，從而影響了BOX的產(chǎn)量；葡萄糖作為速效碳源可明顯提高BOX產(chǎn)量，蔗糖也有類似的效果，可能是因?yàn)檎崽撬夂笠部僧a(chǎn)生葡萄糖；而木糖和甘露糖對(duì)菌株生長(zhǎng)和BOX的分泌具有一定的抑制作用；微晶纖維素雖然不能促進(jìn)菌株IMER1的生長(zhǎng)，但可以促進(jìn)其產(chǎn)酶。

如圖2所示，和對(duì)照相比，在不同氮源中硝酸銨對(duì)菌株IMER1產(chǎn)BOX酶有明顯的促進(jìn)作用，而尿素對(duì)產(chǎn)酶有抑制作用。有機(jī)氮源（蛋白胨、尿素、酵母浸膏）和無(wú)機(jī)氮源（硝酸銨、硫酸銨）相比，無(wú)機(jī)氮源作為一種速效氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響較大。

2.1.2 不同pH的影響 如圖3所示，培養(yǎng)基pH 為7是該菌產(chǎn)酶的最適pH，在中性偏堿性的環(huán)境（pH 7～9）中，BOX產(chǎn)量要比在酸性環(huán)境高，且在pH 4、5時(shí)菌株IMER1生長(zhǎng)較差，而在堿性環(huán)境下，生長(zhǎng)較好。表明菌株IMER1作為一種耐堿性真菌，在中性偏堿性的pH范圍內(nèi)能較好地分泌BOX。

2.1.3 不同溫度的影響 如圖4所示，28 ℃時(shí)菌株IMER1的生長(zhǎng)速度快，BOX產(chǎn)量最大，而在較低溫度22 ℃時(shí)，該菌株生長(zhǎng)較慢，酶產(chǎn)量也較低；在37 ℃時(shí)，菌株IMER1的孢子未能萌發(fā)，所以在其發(fā)酵液中未測(cè)到BOX酶活。結(jié)果表明，最適的產(chǎn)酶溫度為28 ℃，高溫會(huì)抑制孢子的萌發(fā)。

2.1.4 不同金屬離子的影響 如圖5所示，F(xiàn)e3+和Mn2+對(duì)菌株IMER1產(chǎn)BOX有一定的抑制作用，K+、Zn2+、Mg2+對(duì)產(chǎn)酶的影響較小，Na+、Co2+離子對(duì)產(chǎn)BOX有一定的促進(jìn)作用，而Cu2+對(duì)其產(chǎn)酶的促進(jìn)作用最強(qiáng)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化液體培養(yǎng)體系產(chǎn)酶條件

2.2.1 主效因素的確定 Plackett-Burman （PB）法是一種近飽和的2水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它基于非完全平衡塊原理，能用最少的試驗(yàn)次數(shù)估計(jì)出因素的主效應(yīng)，從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素供進(jìn)一步研究。根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，影響菌株IMER1液體發(fā)酵產(chǎn)酶的可能因素包括溫度、pH、氮源、碳源（葡萄糖，Glu）、銅離子等。選用N=8的Plackett-Burman設(shè)計(jì)，并設(shè)3個(gè)空白作為誤差分析項(xiàng)，結(jié)果見表1，各因素所代表的參數(shù)及因素效應(yīng)評(píng)價(jià)見表2。由表2可知，對(duì)菌株IMER1液體發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著影響的因素有碳源、pH和溫度。溫度對(duì)產(chǎn)酶呈正效應(yīng)，碳源和pH則呈較大的負(fù)效應(yīng)。要提高產(chǎn)酶量，應(yīng)適當(dāng)提高溫度，降低葡萄糖的濃度。

2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn) 根據(jù)Plackett-Burman法篩選出的顯著因素效應(yīng)大小設(shè)定它們的步長(zhǎng)，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，尋找最大產(chǎn)酶區(qū)。根據(jù)Glu、pH和溫度3個(gè)因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向及步長(zhǎng)，最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)測(cè)得結(jié)果如表3所示，最大產(chǎn)酶區(qū)在第3次試驗(yàn)附近，故以試驗(yàn)3的條件為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)確定的試驗(yàn)因素與水平詳見表4。

2.2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定顯著因素的最優(yōu)水平 利用最大產(chǎn)酶區(qū)對(duì)應(yīng)的條件進(jìn)行響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以試驗(yàn)結(jié)果擬合建立描述響應(yīng)量（BOX酶活）與自變量（影響產(chǎn)酶的顯著因素）關(guān)系的多項(xiàng)式回歸模型，運(yùn)用SAS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，并對(duì)擬合方程作顯著性檢驗(yàn)及方差分析。三因素五水平的響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)測(cè)得的酶活力結(jié)果見表5。

1）回歸模型的建立及置信度分析。以BOX酶活為響應(yīng)值，根據(jù)表5的試驗(yàn)結(jié)果，用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多元回歸分析，所得的主要分析結(jié)果見表6、表7。從方差分析中可以看出，各試驗(yàn)因素響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。根據(jù)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響，擬合得到多項(xiàng)式回歸模型為：Y1=0.642 963+0.014 722×pH+0.004 44×Glu-0.153 056×T-0.099 537×pH×pH+0.058 889×pH×Glu-0.005×pH×T-0.067 87×Glu×Glu+0.098 889×Glu×T-0.076 204×T×T。

從表6中可以看出，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其因變量和自變量之間的線性關(guān)系是顯著的，決定系數(shù)為98.71%，說(shuō)明回歸方程的擬合程度很好。

2）顯著因素水平的優(yōu)化和驗(yàn)證。運(yùn)用SAS軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行規(guī)范性分析，尋求最大酶活量的穩(wěn)定點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的因素水平，結(jié)合圖6的回歸方程的三維響應(yīng)面圖和等高線圖可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的pH、T、Glu實(shí)際取值分別為5.7、28 ℃、8 g/L，BOX酶活的最大估計(jì)值為0.643 U/mL。在以上優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，共進(jìn)行3次100 mL的搖瓶試驗(yàn)，BOX酶活分別為0.582、0.639、0.662 U/mL，平均值為0.627 U/mL。證明預(yù)測(cè)值0.643 U/mL與試驗(yàn)平均值0.627 U/mL非常接近，同時(shí)比沒(méi)有優(yōu)化前的酶活力0.214 U/mL提高了近2倍。

3 小結(jié)

漆斑菌屬是產(chǎn)BOX的主要真菌，有關(guān)其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化報(bào)道不多。多數(shù)微生物產(chǎn)酶條件優(yōu)化采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)分析，這些方法存在一定的缺陷[14]。本試驗(yàn)通過(guò)整合單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman設(shè)計(jì)，結(jié)合最陡爬坡路徑試驗(yàn)和響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)，對(duì)菌株Myrothecium sp.IMER1在液體培養(yǎng)體系中高效產(chǎn)膽紅素氧化酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了比較理想的結(jié)果。菌株IMER1以PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在外加碳源和氮源中，葡萄糖、蔗糖和硝酸銨能提高BOX產(chǎn)量；在中性偏堿性的pH 7～9范圍內(nèi)，BOX產(chǎn)量要比在酸性條件下高，其最適產(chǎn)酶pH為7；最適產(chǎn)酶溫度為28 ℃；在培養(yǎng)基中加入Cu2+對(duì)產(chǎn)BOX有明顯的促進(jìn)作用。運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化液體體系產(chǎn)BOX酶的條件，結(jié)果表明，在pH、溫度、Cu2+、碳源和氮源等影響因素中，pH、溫度和碳源屬于主效因子。當(dāng)pH、溫度和葡萄糖分別為5.7、28 ℃、8 g/L時(shí)，酶活力可達(dá)到最大優(yōu)化值，比沒(méi)有優(yōu)化前的酶活力量提高近2倍。

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