摘要：采用正交設(shè)計(jì)對(duì)水浸提法、水浸提+微波輔助法、乙醇浸提法、乙醇浸提+微波輔助法進(jìn)行比較，以咖啡提取物中綠原酸的含量為評(píng)判指標(biāo)，考察時(shí)間、溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率等對(duì)提取物有效成分綠原酸含量的影響。采用高效液相色譜法測(cè)定該成分的含量。結(jié)果表明，綠原酸最佳提取工藝為乙醇浸提+微波輔助法，最佳提取條件為微波時(shí)間5 min，功率300 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，此條件下提取綠原酸的含量最高。影響提取的主次因素為：乙醇體積分?jǐn)?shù)>功率>微波時(shí)間。

關(guān)鍵詞：咖啡；綠原酸；高效液相色譜法；正交設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)：S571.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）05-1146-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.030

Abstract： Using the content of chlorogenic acid of coffee as indexes， four extraction methods including water extracting method， water+microwave extracting method， ethanol extracting method and ethanol+microwave extracting method were compared with orthogonal design. The factors affecting the content of chlorogenic acid such as the extracting time， the extracting temperature， the volume fraction of ethanol and microwave power were studied. The content of chlorogenic acid was determined by HPLC. The results showed that the optimal method was ethanol+microwave. The optimal extraction conditions were microwave 5 min， 300 W and 60% ethanol. Under these conditions， the content of chlorogenic acid reached the highest level. The factors affecting extraction efficiency were in the order of volume fraction of ethanol>power>times of microwave extraction.

Key words：coffee；chlorogenic acid；HPLC；orthogonal design

綠原酸又名3-咖啡?？崴?，是植物在有氧呼吸過程中經(jīng)磷酸戊糖途徑中間產(chǎn)物合成的一種苯丙素類物質(zhì)[1]。綠原酸具有抗菌、消炎、解毒、利膽、降壓等作用[2-4]，其在食品、醫(yī)藥和日用化工等領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用[5]。綠原酸作為一種具有多種生物活性的天然物質(zhì)， 已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注， 其提取純化及檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)已成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。但國(guó)內(nèi)有關(guān)從咖啡中提取綠原酸的報(bào)道較少，大多數(shù)是從金銀花、杜仲等材料中提取[6-8]。咖啡是世界三大飲品之一，所含活性成分綠原酸在咖啡豆中的含量占2%～8%[9，10]。本試驗(yàn)主要采用正交分析的方法研究從咖啡中提取綠原酸，用高效液相色譜法測(cè)定該成分的含量，以期為從咖啡中有效提取綠原酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)所用咖啡豆為市售咖啡豆。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇、乙醇為色譜純；冰醋酸為分析純。

Agilent 1100型高效液相色譜儀（配有紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司）；超聲波發(fā)生器（寧波新芝生物科技有限公司）；AUY120型電子天平（日本島津公司）；5418R型冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為漢邦Hedera ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇∶0.1%冰醋酸=30∶70（V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，進(jìn)樣量為5 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精確稱取對(duì)照品綠原酸4.00 mg，以甲醇溶解，并定容至5 mL棕色容量瓶中，得到0.80 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.2.3 樣品溶液配制 精確稱取咖啡豆粉末0.50 g，采用水浸提法、水浸提+微波輔助法、乙醇浸提法、乙醇浸提+微波輔助法4種方法進(jìn)行綠原酸提取工藝的比較，并對(duì)其正交試驗(yàn)影響因素和水平進(jìn)行設(shè)定（表1～表4），以綠原酸含量為考察指標(biāo)，確定最佳提取工藝和條件。

綠原酸含量=C×V×N/W×100%

式中，C為測(cè)量液總綠原酸濃度（mg/mL）；V為粗提液體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；W為原料重量（mg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察 分別吸取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋并在容量瓶中定容，使其濃度分別為0.04、0.08、0.20、0.40、0.60、0.80 mg/mL，按“1.2.1”的色譜條件測(cè)定綠原酸的峰面積，色譜圖見圖1a。以峰面積為縱坐標(biāo)，綠原酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=14 527X-3.377 6（r=0.998 7），表明在綠原酸濃度0.04～0.80 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以咖啡豆粉末為研究對(duì)象分析其綠原酸的含量，色譜分析結(jié)果見圖1b。

2.1.2 精密度考察 取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，綠原酸保留時(shí)間的RSD=0.986%，綠原酸峰面積的RSD=1.054%，表明該液相色譜儀的精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性考察 按樣品溶液制備方法制樣，制得的樣品溶液在室溫下放置0、4、8、12、16、20 h進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，綠原酸保留時(shí)間的RSD=0.921%，峰面積的RSD=1.236%，表明該樣品的穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復(fù)性考察 取咖啡樣品，按供試樣品溶液的制備方法得到6份溶液，精確吸取5 μL， 注入高效液相色譜儀檢測(cè)。結(jié)果表明，綠原酸保留時(shí)間的RSD=0.753%，峰面積的RSD=1.589%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱量5份咖啡樣品，按照樣品中綠原酸含量的0.8、1.0和1.2倍加入對(duì)照樣品，在“1.2.1”的色譜條件下進(jìn)樣5 μL分析，每個(gè)樣品重復(fù)3次進(jìn)樣，按樣品溶液制備方法制樣，結(jié)果樣品的平均回收率為98.43%，RSD為2.32%，表明該樣品提取方法可行。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，水浸提法提取咖啡中綠原酸的最佳條件為A2B1C3，即浸提時(shí)間為50 min，溫度為40 ℃，料液比為1∶30，在此條件下提取咖啡中綠原酸，含量為0.492%。各因素對(duì)綠原酸含量的影響大小順序?yàn)榱弦罕?、浸提時(shí)間、溫度。

由表6可知，水浸提+微波輔助法提取咖啡中綠原酸的最佳條件為A1B2C1，即微波時(shí)間為5 min，功率為400 W，料液比為1∶10，在此條件下提取綠原酸，含量為0.362%。各因素對(duì)綠原酸提取率的影響大小順序?yàn)槲⒉üβ?、時(shí)間、料液比。

由表7可知，乙醇浸提法提取咖啡中綠原酸的最佳條件為A2B1C2，即浸提時(shí)間為50 min，溫度為40 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，在此條件下提取綠原酸，含量為0.348%。各因素對(duì)綠原酸含量的影響大小順序?yàn)闇囟?、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時(shí)間。

由表8可知，乙醇浸提+微波輔助法提取咖啡中綠原酸的最佳條件為A1B1C2，即微波時(shí)間為5 min，功率為300 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，在此條件下提取綠原酸，含量為1.304%。各因素對(duì)綠原酸含量的影響大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)、微波功率、時(shí)間。

3 討論

微波提取技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便、高效、不易破壞天然活性成分等優(yōu)點(diǎn)。由于微波輻射對(duì)吸收介質(zhì)有瞬時(shí)加熱的特性，密封容器有與外界隔絕和增溫增壓的作用，故利用微波浸提技術(shù)，可使樣品在很短時(shí)間內(nèi)得以較完全的浸提[11]。本研究中采用高效液相色譜法分析從咖啡中提取綠原酸的4種方法，結(jié)果表明最佳提取工藝為乙醇浸提+微波輔助法，最佳提取條件為微波時(shí)間5 min，功率300 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，此條件下提取到的綠原酸含量最高。影響提取的主次因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、功率、微波時(shí)間。本研究為從咖啡中提取綠原酸提供了一種高效、節(jié)能的新型提取工藝，為更加廣泛及合理地利用豐富的資源，大力開展綠原酸的提取、純化與綠原酸產(chǎn)品的開發(fā)研究提供了一些理論依據(jù)。

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