摘要：從香料植物天竺葵上分離篩選到一株產(chǎn)香真菌，對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，確定其分類地位，并克隆其產(chǎn)脂肪酶基因進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，分離篩選得到的菌株TZK-1形態(tài)為菌落圓形，質(zhì)地疏松，菌絲由白色變?yōu)榛液稚?，菌絲無隔膜，有假根，孢囊?；颗虼笮纬汕蛐捂咦幽?，孢囊孢子橢圓形；該菌株18S rDNA序列與米根霉Rhizopus oryzae（KF717370）相應(yīng)片段的核苷酸序列同源性為99.6%。利用PCR擴(kuò)增得到脂肪酶基因，該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 108 bp，編碼369個(gè)氨基酸，脂肪酶核苷酸序列與推導(dǎo)的氨基酸序列與Rhizopus oryzae（AF229435）和Rhizopus oryzae（JN689988）聚為一支，支持強(qiáng)度分別達(dá)到92%和95%。結(jié)合形態(tài)學(xué)初步確定，產(chǎn)生濃郁甜酒香味的菌株為米根霉，能產(chǎn)生脂肪酶，克隆其脂肪酶基因全長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：真菌；篩選；脂肪酶；PCR擴(kuò)增

中圖分類號(hào)：S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）05-1227-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.050

Abstract： A strain of aroma-producing fungi isolated from spices plant geranium and identified. Its classification status was determined. The lipase gene was cloned and sequenced. The results showed that colonies of isolated strain TZK-1 were round， loose texture， hyphae from white to gray brown. Microscopic examination of hyphae were observed without the diaphragm， but had a rhizoid， sporangiophore base expanded to form spherical sporangia， sporangiospores oval. 18S rDNA sequence of the strain and Rhizopus oryzae（KF717370） had homology of 99.6%. The lipase gene was amplified by PCR method. The full-length coding region of the gene was 1 108 bp， encoding 369 amino acids. Amino acid sequences of nucleotide sequence of the lipase and Rhizopus oryzae （AF229435） and Rhizopus oryzae（JN689988） were clusteried within a branch， with homology of 92% and 95%， respectively. Combined with a preliminary determination of morphology， the strains of Rhizopus oryzae had strong wine flavor， produced lipase. The full-length of lipase gene was cloned.

Key words： fungi；screening；lipase；PCR amplification

脂肪酶（Lipase，E.C.3.1.1.3）是一類特殊的酯酶，可以在油水界面上催化長(zhǎng)鏈甘油酯水解為長(zhǎng)鏈脂肪酸和甘油，在非水相系統(tǒng)中，可以催化轉(zhuǎn)酯和酯合成等多種反應(yīng)[1]。通過改變反應(yīng)體系的水含量便可以控制脂肪酶催化的反應(yīng)方向，可以進(jìn)行水解、酯合成、酯交換、轉(zhuǎn)酯化等一系列反應(yīng)。脂肪酶在常溫常壓下反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高和特異性強(qiáng)，不易產(chǎn)生副產(chǎn)物等特點(diǎn)，從而能避免化學(xué)催化帶來的有害物質(zhì)。因此，脂肪酶越來越多地運(yùn)用于光學(xué)活性化合物和天然產(chǎn)物的合成，如在食品、飼料、洗滌、紡織、能源等加工業(yè)中應(yīng)用廣泛[2，3]，成為重要的工業(yè)酶制劑之一。脂肪酶廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，其中微生物脂肪酶具有種類多、底物專一性類型多、獨(dú)立的脂肪酶基因易獲得等優(yōu)點(diǎn)[4]，因而微生物是脂肪酶的一個(gè)重要來源，其中根霉屬（Rhizopus sp.）是脂肪酶的重要生產(chǎn)菌[5]。根霉屬（Rhizopus sp.）是一類分布較為廣泛的真菌，屬于接合綱毛霉目毛霉科，分布于酒曲、植物殘?bào)w、腐敗有機(jī)物、動(dòng)物糞便和土壤中，在傳統(tǒng)和現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中有著重要作用。其中與生物技術(shù)相關(guān)的根霉有匍枝根霉（R.stolonifer）、華根霉（R.chinensis）[6]、德氏根霉（R. delemar）[7]和米根霉（R.oryzae）[8-11]。目前已從根霉屬中分離到超過30種脂肪酶，如米根霉脂肪酶、雪白根霉脂肪酶、德氏根霉脂肪酶等，這些酶已經(jīng)商品化，如根霉脂肪酶用于芳香酯[6]、生物柴油[12]、手性化合物[13]等有機(jī)化學(xué)物的制備，因此根霉脂肪酶具有一定的研究?jī)r(jià)值。

目前，已經(jīng)從不同種屬的微生物中分離得到產(chǎn)脂肪酶菌株，并對(duì)其進(jìn)行了深入研究。隨著分子生物學(xué)[14]的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外報(bào)道了不同來源微生物脂肪酶基因已被成功克隆[15]，通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析脂肪酶序列，可以發(fā)現(xiàn)在相同或者相近的種屬內(nèi)脂肪酶的同源性相對(duì)較高，從而找到相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域。本研究從石林香料植物天竺葵葉表面分離到一株產(chǎn)脂肪酶菌株，通過提取基因組DNA以真菌通用引物（ITS1/ITS4）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并結(jié)合形態(tài)學(xué)對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，然后設(shè)計(jì)引物利用PCR擴(kuò)增米根霉脂肪酶全基因序列，并對(duì)分離菌株進(jìn)行發(fā)酵代謝成分分析，為米根霉的運(yùn)用提供了異源表達(dá)和分子育種材料，為其代謝產(chǎn)物的研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 由石林香料天竺葵樣品中自行分離、純化并保存的菌株。

1.1.2 主要試劑和儀器 酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、乙酸乙酯、無水硫酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純；2×Power Taq PCR Master Mix試劑盒、BM2000 DNA Mark購自北京百泰克生物有限公司；引物合成及測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。儀器包括離心機(jī)、PCR儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、美國(guó)Agilent 7890/5975型氣質(zhì)聯(lián)用儀、Agilent色譜工作站、NIST 05譜庫等。

1.1.3 培養(yǎng)基 酵母液體培養(yǎng)基：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，加水定容至1 000 mL。酵母固體培養(yǎng)基：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，加水定容至1 000 mL。油脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、NaCl 5 g、香油10 g、1.6%中性紅水溶液1 mL、瓊脂20 g，加水定容至1 000 mL，pH 7.2。發(fā)酵液體培養(yǎng)基：蓖麻油5 mL、吐溫-80 0.2 g、市售麥芽粒20 g，加水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)香菌株的分離和篩選 將天竺葵的葉片用無菌剪刀由葉柄端剪下接種于裝有30 mL已滅菌的酵母液體培養(yǎng)基的200 mL三角瓶中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)2～3 d，待培養(yǎng)基變渾濁，樣品表面形成菌時(shí)將其進(jìn)行梯度稀釋，涂布于新鮮的酵母固體培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后進(jìn)行純化培養(yǎng)并將其接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d，通過嗅覺初步判斷發(fā)酵液是否產(chǎn)生香味，斜面保存菌種。

利用因pH改變而變色的化合物作為指示劑對(duì)產(chǎn)脂肪酶菌株進(jìn)行篩選，先將分離、純化的菌株接種于酵母固體培養(yǎng)基平板中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3 d，進(jìn)行菌種活化，待其生長(zhǎng)后再將其接種于油脂培養(yǎng)基平板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌生長(zhǎng)后觀察平板底層，如果出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)則為陽性，說明有脂肪酶產(chǎn)生。

1.2.2 產(chǎn)香菌株的形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA鑒定

1）形態(tài)學(xué)觀察。將菌株接種于酵母培養(yǎng)基平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d。參考《真菌分類學(xué)鑒定手冊(cè)》[16]對(duì)菌落形態(tài)和顯微形態(tài)進(jìn)行觀察。

2）DNA提取和ITS rDNA 序列PCR擴(kuò)增。用酵母培養(yǎng)基平板培養(yǎng)TZK-1，待其生長(zhǎng)后刮取并收集菌絲，根據(jù)He[17]SDS-CTAB法提取該菌株基因組總DNA，略有改進(jìn)。以提取的總DNA為模板，用ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用2×Power Taq PCR Master Mix 試劑盒，擴(kuò)增總體系50 ？滋L。反應(yīng)體系：2×Power Taq PCR Master Mix 25 ？滋L，上、下游引物各2 ？滋L，DNA 11 ？滋L，ddH2O 10 ？滋L。擴(kuò)增條件：94 ℃，3 min；94 ℃，40 s；55 ℃，40 s；72 ℃，1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，并用Bioedit軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，再提交序列至GenBank，獲取登錄號(hào)。

1.2.3 脂肪酶基因擴(kuò)增及其序列分析 以提取的基因組總DNA為模板，根據(jù)脂肪酶高度保守序列的引物Z1、Z2（表1）對(duì)該基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR擴(kuò)增體系同上，采用2×Power Taq PCR Master Mix 試劑盒。擴(kuò)增條件：94 ℃，3 min；94 ℃，1 min；52 ℃，45 s；72 ℃，1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果在NCBI上對(duì)保守序列進(jìn)行比對(duì)，選取同源性高的菌株，利用Clustal W2軟件對(duì)選取菌株進(jìn)行比對(duì)，尋找保守序列。利用Primer 5.0軟件根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)引物Z3、Z4（表1），對(duì)該菌脂肪酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR擴(kuò)增體系同上。反應(yīng)條件：94 ℃，3 min；94 ℃，1 min；59 ℃，45 s；72 ℃，1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)測(cè)序得到的上述2次核苷酸序列拼接設(shè)計(jì)引物L(fēng)AD1-1（表1），利用引物L(fēng)AD1-1、Z2 PCR擴(kuò)增該脂肪酶的全基因序列，PCR擴(kuò)增體系同上。反應(yīng)條件：94 ℃，3 min；94 ℃，1 min；52 ℃，45 s；72 ℃，1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送去測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用BLAST搜索GenBank數(shù)據(jù)庫中與該序列同源性較高的菌株序列，采用Bioedit軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，利用軟件MEGA 5.0以Neighbor-Joining法構(gòu)建產(chǎn)脂肪酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香菌株的分離、篩選

利用酵母液體培養(yǎng)基對(duì)天竺葵的葉片進(jìn)行富集培養(yǎng)，酵母培養(yǎng)基變渾濁，樣品表面有菌形成，將其進(jìn)行梯度稀釋涂布于酵母固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，成功分離得到菌株，對(duì)其進(jìn)行純化。再將分離、純化的菌株接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)香篩選，培養(yǎng)3 d后對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行產(chǎn)香嗅覺初步判斷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離、純化得到的菌株能產(chǎn)生濃郁的甜酒香味，成功篩選得到一株產(chǎn)香菌株。將分離、純化的產(chǎn)香菌株命名為TZK-1。將TZK-1菌株接入油脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，以篩選產(chǎn)生脂肪酶的菌株，經(jīng)過37 ℃恒溫培養(yǎng)2 d觀察到TZK-1菌株平板底層出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，如圖1所示。由此可見，該菌株為脂肪酶產(chǎn)生菌。

2.2 產(chǎn)香菌株的形態(tài)學(xué)和18S rDNA鑒定

TZK-1菌株在酵母培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后，菌落圓形，質(zhì)地疏松，菌絲由白色變?yōu)榛液稚辉陲@微鏡下觀察到菌絲無隔膜，有假根，孢囊?；颗虼笮纬汕蛐捂咦幽?，孢囊孢子橢圓形，如圖2所示。參考真菌分類鑒定手冊(cè)，初步確定為根霉屬。以TZK-1菌株的DNA為模板，利用真菌通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)相應(yīng)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，該菌株長(zhǎng)度為611 bp，將序列提交GenBank獲得登陸號(hào)為KJ755444。利用BLAST軟件將所得基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行同源性比較分析，利用Bioedit進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果見表2。分析結(jié)果表明，TZK-1菌株與Rhizopus oryzae（KF717370）菌株的同源性較高，達(dá)到99.6%，TZK-1菌株與米根霉可能具有共同的起源。

2.3 脂肪酶基因擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

以提取的TZK-1總DNA為模板，利用引物Z1、Z2進(jìn)行脂肪酶基因PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到約400 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果一致。根據(jù)測(cè)序結(jié)果在NCBI上對(duì)保守序列進(jìn)行比對(duì)，選取同源性高的菌株，利用Clustal W2軟件對(duì)選取的菌株進(jìn)行比對(duì)，尋找保守序列。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)的引物Z3、Z4對(duì)該菌脂肪酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到約800 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果一致。

根據(jù)2次測(cè)序結(jié)果拼接核苷酸序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)AD1-1，利用引物L(fēng)AD1-1、Z2擴(kuò)增完整的目的基因，經(jīng)測(cè)序、拼接得到完整的脂肪酶基因，該脂肪酶基因片段大小為1 108 bp，編碼369個(gè)氨基酸。經(jīng)過3次PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增得到脂肪酶基因，并利用凝膠成像系統(tǒng)觀察，結(jié)果如圖3所示。

將擴(kuò)增得到的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對(duì)，選取比對(duì)的14組核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用軟件MEGA 5.0以Neighbor-Joining法構(gòu)建產(chǎn)脂肪酶菌株的核苷酸系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，菌株TZK-1與Rhizopus oryzae（AF229435）和Rhizopus oryzae（JN689988）聚為一支，支持強(qiáng)度達(dá)到92%，同源性分別達(dá)到99.5%和96.6%，與其同源性最低的是Rhizopus microsporus var. chinensis（EF405962），同源性為55.6%，可以看出TZK-1脂肪酶在遺傳距離上與Rhizopus oryzae比較近，與Rhizopus microsporus var. chinensis較遠(yuǎn)。

將擴(kuò)增得到的米根霉脂肪酶基因序列翻譯成氨基酸序列后，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建產(chǎn)脂肪酶菌株的氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，菌株TZK-1與Rhizopus oryzae（AF229435）和Rhizopus oryzae（JN689988）聚類成一支，支持強(qiáng)度達(dá)到95%，同源性分別達(dá)到97.5%和96.1%，與其同源性最低的是Synthetic construct（GU475119），同源性為9.7%。由此可知，無論在核苷酸水平還是氨基酸水平上，擴(kuò)增得到的脂肪酶都與Rhizopus oryzae脂肪酶具有較高的相似性，因此初步認(rèn)為擴(kuò)增得到的脂肪酶基因?yàn)槊赘怪久富颉?/p>

3 小結(jié)與討論

米根霉脂肪酶具有高度的1、3位置特異性，可以水解和再合成三甘油酯的第一位酯鍵，可以用來水解、重組脂肪和油脂，在芳香酯、手性化合物、生物柴油等有機(jī)物的合成中具有較高價(jià)值。伴隨著脂肪酶的商業(yè)價(jià)值問題也是突出的，其中包括天然菌株產(chǎn)脂肪酶產(chǎn)量低，酶與菌體分離純化困難，產(chǎn)物純度達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)要求等問題，因此利用分子生物學(xué)手段擴(kuò)增脂肪酶基因作為一種高效表達(dá)的生產(chǎn)方法已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。

本研究從采集的香料植物天竺葵樣品中分離得到一株產(chǎn)脂肪酶菌株，通過對(duì)該菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明該菌株與米根霉（Rhizopus oryzae）具有最高的遺傳相似性，再結(jié)合形態(tài)學(xué)可以確定該菌株為米根霉。通過PCR擴(kuò)增該菌株脂肪酶基因和NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增得到的脂肪酶基因與NCBI提交的Rhizopus oryzae（AF229435）和Rhizopus oryzae（JN689988）脂肪酶核苷酸和氨基酸序列具有著較高的同源性。說明本研究成功擴(kuò)增得到全長(zhǎng)為1 108 bp，編碼369個(gè)氨基酸的基因可能為米根霉脂肪酶基因，為挖掘我國(guó)的產(chǎn)脂肪酶微生物及其對(duì)脂肪酶的研究提供了材料。

TZK-1菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中，能產(chǎn)生濃郁的甜酒香味，這種香味的存在可能與菌株產(chǎn)生的某種或某些代謝產(chǎn)物有關(guān)，同時(shí)菌株代謝過程中產(chǎn)生的甜酒氣味可能與脂肪酶的存在有著某種聯(lián)系，這對(duì)米根霉產(chǎn)香化合物的發(fā)酵優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。探究該菌產(chǎn)香化合物的發(fā)酵優(yōu)化及其產(chǎn)生的有關(guān)代謝產(chǎn)物組成，并對(duì)產(chǎn)香代謝化合物進(jìn)行分離、提純將成為后期研究的內(nèi)容。

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