[摘要] 目的 研究母乳對壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis， NEC）炎癥細(xì)胞的分子保護機制。 方法 通過建立Caco-2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，向正常細(xì)胞和缺氧復(fù)氧損傷模型細(xì)胞分別加入常規(guī)培養(yǎng)液、未加熱乳清、加熱滅活乳清。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后用ELISA法檢測Caco-2細(xì)胞分泌于培養(yǎng)液中的促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。 結(jié)果 正常細(xì)胞組，未加熱乳清和加熱滅活乳清均可下調(diào)IL-1β、IL-6水平，未加熱乳清較加熱滅活乳清下調(diào)明顯，兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；缺氧復(fù)氧損傷后IL-1β、IL-6、TNF-α均明顯表達，未加熱乳清和加熱滅活乳清均可下調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，未加熱乳清較加熱滅活乳清下調(diào)IL-1β明顯。 結(jié)論 母乳上清液可下調(diào)Caco-2炎癥細(xì)胞促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6的表達，尤其缺氧復(fù)氧損傷后TNF-α也下調(diào)明顯，此類機制可能為母乳防治NEC的作用機制之一。

[關(guān)鍵詞] 壞死性小腸結(jié)腸炎；母乳；IL-1β；IL-6；TNF-α

[中圖分類號] R5 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）02（a）-0001-03

The Impact of Human Breast Milk on the Expression of Proinflammatory Cytokine in Caco-2 Cells after Hypoxia/Reoxygenation

WANG Yujun RUAN Weiyong FENG Weiwei BU Weiquan BI Mingyuan

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing， Jiangsu Province， 210028， China

[Abstract] Objective To study the mechanisms of breast milk in preventing necrotizing enterocolitis（NEC） through the level of cellular and molecular biology. Methods We induced Caco-2 cells model of NEC after hypoxia/reoxygenation. The normal cell group and model cell of hypoxia/reoxygenation group was divided into three subgroups： ①conventional culture fluid； ②unheated breast milk supernatant fluid； ③heat-inactivated breast milk supernatant fluid. All cells were continually cultured for six hours， then we detected the expression of IL-1β， IL-6 and TNF-α proinflammatory cytokines secreted by Caco-2 cells in the nutrient fluid with ELISA method. Results In normal cell group， both unheated or heat-inactivated breast milk supernatant fluid could inhibit the expression of IL-1β and IL-6. Compared with the heat-inactivated breast milk supernatant fluid， the inhibition effect of unheated breast milk supernatant fluid was better， and the difference had statistical significance. The expression of IL-1β， IL-6 and TNF-α was obvious after hypoxia/reoxygenation， and unheated or heat-inactivated breast milk supernatant fluid could inhibit the expression of IL-1β， IL-6， TNF-α with statistical significance. Compared with the heat-inactivated breast milk supernatant fluid， the inhibition effect of unheated breast milk supernatant fluid on the expression of IL-1β was more obvious. Conclusion Breast milk supernatant fluid can inhibit the expression of proinflammatory cytokines IL-1β， IL-6 as well as TNF-α in Caco-2 cells especially after hypoxia/reoxygenation， this may be one of the mechanisms of breast milk in preventing NEC.

[Key words] Necrotizing enterocolitis； Breast milk； IL-1β； IL-6； TNF-α

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis， NEC）是新生兒尤其是早產(chǎn)兒時的嚴(yán)重胃腸道疾病，預(yù)后差，國內(nèi)該病的病死率為10% ～50%[1]。研究證實，細(xì)胞凋亡是NEC早期腸上皮細(xì)胞死亡的主要形式，是NEC進一步發(fā)展的必經(jīng)階段[2]。腫瘤壞死因子-α、脂多糖內(nèi)毒素、血小板活化因子等在NEC的發(fā)病中起重要作用[3]。盡管目前對NEC發(fā)病機制研究取得很大進展，但分子生物學(xué)機制還沒完全闡明，缺乏特效的治療手段[4]。本實驗旨在通過母乳[5]干預(yù)Caco-2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷， 研究其促炎細(xì)胞因子表達情況，探討母乳防治NEC的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 母乳成份上清液的提取

生后2～4 d的母乳（來自該院產(chǎn)科2012年6月—2013年12月正常分娩產(chǎn)婦）存于 4 ℃ 冰箱， 在24 h內(nèi)處理， 12 000 r/ min離心10 min去除脂肪成分和細(xì)胞碎片， 保留乳清（未加熱乳清）用于實驗，通過煮沸5 min以滅活熱敏感蛋白或多肽，再次12 000轉(zhuǎn)/min離心10 min獲得上清液為滅活乳清，未加熱乳清和滅活乳清均存于-20 ℃ 冰箱備用。

1.2 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞（細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫）適宜在37 ℃、5% CO2和90%相對濕度的環(huán)境中培養(yǎng)，采用DMEM培養(yǎng)基，包含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素雙抗液。細(xì)胞培養(yǎng)在75 cm2培養(yǎng)瓶中，每5 d按1∶3的比例傳代，傳代后6～7 d細(xì)胞生長達到融合。

1.3 Caco-2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型的建立

取傳代后第6天生長達到融合的Caco-2細(xì)胞，吸去90%的培養(yǎng)液，以減少氣體彌散距離，剩余培養(yǎng)液能維持細(xì)胞存活。將其置入密閉容器中，負(fù)壓抽吸其中空氣，換入高純氮氣，密閉后置入培養(yǎng)箱中孵育90 min（缺氧），再取出，加培養(yǎng)液至原量，置入培養(yǎng)箱中孵育30 min（復(fù)氧）[6]。

1.4 實驗分組

Caco-2細(xì)胞接種于6孔板，接種密度1×105/孔。分為正常細(xì)胞組和缺氧復(fù)氧損傷細(xì)胞組兩大組，每組均分小組：A組為常規(guī)培養(yǎng)液組（MEM）；B組為未加熱乳清組（以上制備的5% 乳清5%BM），C組為滅活乳清組（煮沸過的5%乳清5%BMb）。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后用ELISA法檢測Caco-2細(xì)胞分泌于培養(yǎng)液中的促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.5 統(tǒng)計方法

該研究數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件包進行處理，計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果

與MEM正常細(xì)胞組相比，MEM缺氧復(fù)氧損傷組IL-1β、IL-6、TNF-α均明顯表達，（t=16.112、9.468、6.593，P<0.05）；正常細(xì)胞組中：單因素方差分析，IL-1β、IL-6表達均較常規(guī)培養(yǎng)液組有，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），TNF-α下降差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），LSD法進一步兩兩比較，BM組IL-1β下降較BMb組更多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），BM組和BMb 組IL-6差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。缺氧復(fù)氧損傷細(xì)胞組中：單因素方差分析，IL-1β、IL-6、TNF-α表達均較MEM組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），LSD法進一步兩兩比較，BM組IL-1β下降較BMb組更多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），BM組和BMb 組之間的IL-6、TNF-α下降差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Caco-2細(xì)胞分泌于各培養(yǎng)液中的促炎因子水平比較，見表1。

表1 Caco-2細(xì)胞分泌于培養(yǎng)液中的各促炎因子水平（x±s）

3 討論

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）是新生兒尤其是早產(chǎn)兒常見的消化道危急重癥，其診斷和治療仍然面臨很多困難。迄今為止，NEC的病因及發(fā)病機制尚未完全明確，目前認(rèn)為是由于早產(chǎn)、缺氧、低體溫、喂養(yǎng)不當(dāng)、腸道缺血、感染等多種因素綜合作用所致。母乳喂養(yǎng)是一個保護因素，據(jù)報道人工喂養(yǎng)兒比母乳喂養(yǎng)兒NEC的發(fā)病率明顯提高，因母乳含有多量的表皮生長因子等，能有效預(yù)防發(fā)生壞死性小腸結(jié)腸炎[7]。該實驗中，體外培養(yǎng)了與人腸上皮細(xì)胞生物學(xué)功能相似的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系，從細(xì)胞及分子生物學(xué)水平進一步探討母乳防治NEC的有效性及具體作用機制。

Caco-2細(xì)胞來源于人體結(jié)腸腺癌細(xì)胞，同源性好。由于Caco-2細(xì)胞在培養(yǎng)條件下可自發(fā)進行上皮樣分化并可形成緊密聯(lián)結(jié)，其形態(tài)學(xué)、標(biāo)志酶的功能表達及滲透特征與小腸類似，可以作為研究小腸表皮細(xì)胞的藥物轉(zhuǎn)運、吸收和代謝的體外模型。因而被國內(nèi)外大多數(shù)實驗采用。

細(xì)胞因子是指主要由免疫細(xì)胞分泌的小分子多肽，具有介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫、炎癥和造血過程的功能，對機體感染、免疫應(yīng)答、炎癥以及創(chuàng)傷具有重要的調(diào)節(jié)作用。促炎細(xì)胞因子主要有IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ等。腸缺血/再灌注損傷是腸粘膜屏障功能損傷的常見原因，已經(jīng)證實，缺血/再灌注可激活內(nèi)皮細(xì)胞，引起局部細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡及某些細(xì)胞因子、粘附分子的過度表達，從而引起白細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷[8]。該實驗缺氧復(fù)氧損傷細(xì)胞組促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α均明顯表達，與文獻報道一致，進一步證實細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡與NEC發(fā)病機制有關(guān)。

前期實驗中，1%和5%母乳上清液對Caco-2炎癥細(xì)胞均有抑制作用，后者作用略為明顯，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），該實驗綜合考慮選擇5%母乳上清液作為實驗用濃度。正常細(xì)胞組，未加熱乳清和加熱滅活乳清均可下調(diào)IL-1β、IL-6水平，但下調(diào)TNF-α差異無統(tǒng)計學(xué)意義，未加熱乳清較加熱滅活乳清下調(diào)IL-1β明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；缺氧復(fù)氧損傷細(xì)胞組，未加熱乳清和滅活乳清均可下調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α水平，具有統(tǒng)計學(xué)意義，未加熱乳清較加熱滅活乳清下調(diào)IL-1β更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明母乳可下調(diào)Caco-2炎癥細(xì)胞促炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6）的表達，尤其缺氧復(fù)氧損傷后下調(diào)均有統(tǒng)計學(xué)意義（IL-1β、IL-6、TNF-α），進一步證明此機制可能為母乳防治NEC的作用機制之一。母乳含有多種有生物學(xué)作用的有效成分，加熱滅活熱敏感蛋白或多肽可能影響這些成分的生物學(xué)作用，與未加熱乳清比較，對IL-1β部分影響的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可能與采用的濃度相關(guān)，今后的研究可關(guān)注濃度含量的影響[9]。

NEC的發(fā)病機制復(fù)雜，研究表明可能與Toll樣受體（Toll-like receptor， TLR）、核轉(zhuǎn)錄因子信號傳導(dǎo)的異常激活等相關(guān)[10]。對細(xì)胞因子調(diào)控的分子機制，如母乳對腸上皮細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子、Toll樣受體表達如何影響，正在系列研究中將作進一步探討。

[參考文獻]

[1] Hans Van Goudoever， 陳超，張蓉. 新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎的熱點問題[J].中國循證兒科雜志，2011， 6（5）：321-323.

[2] Karatepe HO， Kilincaslan H， Berber M， et al. The effect of vascular endothelial growth factor overexpression in experimental necrotizing enterocolitis[J]. Pediatr Surg Int， 2014， 30（3）：327-332.

[3] Yurttutan S， Ozdemir R， Canpolat FE， et a1. Beneficial effects of Etanercept on experimental necrotizing enterocolitis[J].Pediatr Surg Int， 2014， 30（1）：71-77.

[4] Gane B， Bhat BV， Adhisivam B， et a1. Risk Factors and Outcome in Neonatal Necrotising Enterocolitis[J].Indian J Pediatr，2014，81（5）：425-428.

[5] Kasivajjula H， Maheshwari A. Pathophysiology and Current Management of Necrotizing Enterocolitis[J]. Indian J Pediatr，2014，81（5）：489-497.

[6] 孫炳偉， 趙小辰， 王廣基，等. 缺氧復(fù)氧損傷后小腸上皮細(xì)胞刷狀緣二肽轉(zhuǎn)運載體生物學(xué)功能的改變及生長激素的調(diào)控作用[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志， 2003，28（11）： 1025-1027.

[7] Gregory KE， Walker WA. Immunologic Factors in Human Milk and Disease Prevention in the Preterm Infant[J].Curr Pediatr Rep，2013，1（4）：222-228.

[8] Geng Y，Li J，Wang F， et a1. Epidermal Growth Factor Promotes Proliferation and Improves Restoration After Intestinal Ischemia–Reperfusion Injury in Rats[J].Inflammation，2013，36（3）：670-679.

[9] Liu Y， Fatheree NY， Mangalat N， et al. Lactobacillus reuteri strains reduce incidence and severity of experimental necrotizing enterocolitis via modulation of TLR4 and NF-kB signaling in the intestine[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2012， 302（6）：G608-617.

[10] Winterberg T，Vieten G，F(xiàn)eldmann L， et al.Neonatal murine macrophages show enhanced chemotactic capacity upon toll-like receptor stimulation[J].Pediatr Surg Int，2014，30（2）：159-164.

（收稿日期：2014-10-21）