摘 要：為了評估霉菌毒素吸附劑在動物體內(nèi)的功效，根據(jù)歐洲的相關(guān)指南應(yīng)該測量其特定的毒物代謝動力學(xué)參數(shù)。出于此目的，研究人員著重介紹了豬吸收模型的吸收動力學(xué)。在該模型中，試驗(yàn)豬單獨(dú)或與活性碳（用作霉菌毒素的粘合劑）一起口服大丸粒霉菌毒素——嘔吐毒素（DON）。在單獨(dú)喂給嘔吐毒素后，可從豬的血液中檢測到了高水平的嘔吐毒素，并用房室模型（compartmental model）計(jì)算霉菌毒素在體內(nèi)的動力學(xué)參數(shù)?；钚蕴磕軌驈氐追乐箛I吐毒素的吸收，因?yàn)閲I吐毒素與活性碳同時喂給豬后，未能從豬體內(nèi)檢測到該毒素。

關(guān)鍵詞：嘔吐毒素；吸收模型；豬；霉菌毒素粘合劑；效果測試

中圖分類號：S816.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：C 文章編號：1001-0769（2015）05-0097-03

飼料污染霉菌毒素是一種能夠?qū)е聞游锷a(chǎn)性能損失的持續(xù)性飼料安全問題。因此，研究人員開發(fā)出了各種能夠解除污染飼料加霉菌毒素的方法，但霉菌毒素解毒劑似乎是最有應(yīng)用前景的方法，因此也是最常用的方法。這些解毒劑可分成兩個不同的類型，即霉菌毒素粘合劑和霉菌毒素改性劑。這兩種類型的去毒方法有著不同的作用方式：霉菌毒素吸附劑在動物腸道中吸附毒素，產(chǎn)生毒素——吸附劑復(fù)合物，并通過糞便排出；而霉菌毒素吸附劑能夠?qū)⒍舅馗淖兂蔁o毒性的代謝物。這些添加劑的大量使用導(dǎo)致歐盟于2009年設(shè)立了一個新的飼料添加劑組——霉菌毒素解毒劑。這些化合物被定為“可減少霉菌毒素對飼料污染的物質(zhì)”能夠抑制或減少毒素的吸收，促進(jìn)霉菌毒素的排出，或改變它們作用模式的物質(zhì)。

對這些產(chǎn)品的功效已經(jīng)進(jìn)行了大量的評估。體內(nèi)效能試驗(yàn)通常是基于所謂的非特異性參數(shù)進(jìn)行的，評估動物的生產(chǎn)性能、血液生化或血液參數(shù)、器官重量、對免疫功能的影響、組織學(xué)變化等。由于這些標(biāo)準(zhǔn)都具有非特異性，處理和未處理的動物之間產(chǎn)生的差異不能完全歸因于解毒劑的功效。這中間有可能涉及到很多混合效應(yīng)，如β-葡聚糖免疫調(diào)節(jié)活性及其他飼料成分的抗氧化作用。區(qū)分特定和非特定效應(yīng)的一種可行方法是飼喂添加了解毒劑的無污染飼料。然而，歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）提出了基于特定動力學(xué)參數(shù)的其他端點(diǎn)。由于霉菌毒素吸附劑是在動物腸道中吸附霉菌毒素的，因此可以預(yù)期其在腸道中的吸收率較低。根據(jù)EFSA的要求，可以評估這些產(chǎn)品功效的最相關(guān)的參數(shù)是這些毒素或它們的主要代謝物在血漿中的濃度。EFSA提出了通過將霉菌毒素和解毒劑混合進(jìn)飼料中再喂給動物進(jìn)行短期的飼養(yǎng)試驗(yàn)。該霉菌毒素的血漿濃度和主要的代謝產(chǎn)物（多個），應(yīng)在不少于5 d的一個階段中和不短于一周（穩(wěn)態(tài)設(shè)計(jì)）的采樣前階段中進(jìn)行監(jiān)測。此外，非特異性參數(shù)也需進(jìn)行監(jiān)測。這種飼養(yǎng)試驗(yàn)既花勞動力，又高投入。與此相反，利用毒物代謝動力學(xué)模型進(jìn)行監(jiān)測，將無須太多的勞動力和投入，在此模型中霉菌毒素單獨(dú)或與解毒劑一起喂給試驗(yàn)動物。

本研究的目的是根據(jù)EFSA準(zhǔn)則評估大丸粒吸收模型，以研究霉菌毒素解毒劑對口服攝入的嘔吐毒素（DON）的解毒效應(yīng)。

1 結(jié)果與討論

試驗(yàn)豬在按每千克體重單次口服0.05 mg DON后，測定其血液中可量化的DON水平（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在吸收參數(shù)上，公豬和母豬之間未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異（數(shù)據(jù)未顯示）。血漿濃度-時間曲線擬合符合房室模型（compartmental model）。1.33 h的Tmax值與Goyaerts和D?nicke（2006）報道的1.65 h相當(dāng)。另一方面，29.7 mg/mL的Cmax值相對高于Goyaerts和D?nicke （2006）的結(jié)果（每千克體重口服0.08 mg DON后，血液中濃度為15.1 mg/mL）。然而，采食量可以影響DON的口服獲得量，這可以解釋在本研究中禁食豬的Cmax值高于Goyaerts和D?nicke（2006）所獲結(jié)果的原因。DON的其他動力學(xué)參數(shù)接近Goyarts等（2006）和D?nicke等（2004）的研究結(jié)果。本研究未能在血液中檢測到DON的主要代謝產(chǎn)物——脫環(huán)氧脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DOM-1）。這與先前的文獻(xiàn)報道相關(guān)，該文獻(xiàn)報道在豬全身血液循環(huán)中DOM-1占總DON濃度的1.4 %～1.7 %。

為了檢驗(yàn)豬的這一模型的效力，DON還與活性炭（AC）一起飼喂，因?yàn)檠芯勘砻魉谌怆u體內(nèi)能夠強(qiáng)烈地吸附DON。DON的吸收完全被活性碳阻斷，因?yàn)樵谘逯形茨軝z測到高于檢測限（LOD）的DON。這表明此吸收動力學(xué)模型適用于評估霉菌毒素吸附劑對豬口服DON的吸收阻斷效果。如上所述，AC可以用作陽性對照，因?yàn)樗且环N常用的解毒劑，可吸附多種化合物，包括霉菌毒素，如DON。然而，活性碳的商業(yè)應(yīng)用應(yīng)該避免，以便盡量減小降低營養(yǎng)吸收率和損害飼料營養(yǎng)價值的風(fēng)險。

2 試驗(yàn)材料

2.1 化學(xué)藥品、產(chǎn)品和藥劑

用于此動物分析試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)DON購自以色列的Fermentek公司。DOM-1購自比利時的Sigma-Aldrich公司。內(nèi)標(biāo)物（Internal standard，IS） 13C15-DON購自澳大利亞的Biopure公司。這些標(biāo)準(zhǔn)物儲存在-15 ℃以下的環(huán)境中。試驗(yàn)所用的水、甲醇和乙腈（ACN）為LC-MS級，購自荷蘭的Biosolve公司；冰醋酸為分析純，購自比利時VWR公司；Millex?-GV-PVDF濾波器（0.22 μm）購自比利時Merck-Millipore公司。

2.2 試驗(yàn)動物

8頭體重20.2 kg±1.4 kg的混合性別仔豬購自比利時BiocentreAgrivet公司，并飼養(yǎng)在四個不同的豬欄中（±4 m2/間，2頭/間），豬欄溫度保持在 18 ℃～25 ℃，相對濕度為40 %～80 %之間。豬舍采用環(huán)境自然光照方案。試驗(yàn)豬經(jīng)一周適應(yīng)馴化期后，禁食12 h，隨后按每千克體重0.05 mg的劑量，用胃管強(qiáng)制性一次口服DON。這一劑量相當(dāng)于每千克飼料污染1 mg DON的水平。試驗(yàn)所用DON為大丸藥，先溶于乙醇（1 mg/mL）中，并用飲用水進(jìn)一步稀釋到 10 mL。4頭試驗(yàn)豬服用這些DON大丸藥和活性炭（AC）（劑量：0.1 g/kg體重，類似于飼料中2 g/kg的添加量），懸浮在10 mL飲用水中。服用后，胃管立即用50 mL飲用水沖洗。血液樣本于DON口服前（0 min）和口服后0.33、0.66、1、1.5、2、3、4、6、8、10和12 h取樣。采取的血樣置于含有肝素的試管中，并在離心力2 851×g和溫度4 ℃下離心10 min。血樣按每份250 μL進(jìn)行等分，隨后儲存在≤-15 ℃下備用。

2.3 DON的血漿定量

血樣按Devreese等所述的方法進(jìn)行分析。簡言之，將12.5 μL內(nèi)標(biāo)物和750 μL乙腈加入250 μL的血漿中，隨后進(jìn)行渦旋混合（15 min）和離心（8 517×g、 10 min、4 ℃）。接著，上清液轉(zhuǎn)移到另一試管中，使用溫和的氮?dú)猓∟2）氣流蒸發(fā)（45±5）℃。干的殘留物用200 μL的水/甲醇液（85/15，體積/體積）重新配制成原有的濃度。經(jīng)渦旋混合（15 min）后，樣本經(jīng)過Millex?GV-PVDF過濾器（0.22 μm）轉(zhuǎn)移到一個自動采樣瓶中。等分試樣（5 μL）并注射到LC-MS/MS儀器中。LC系統(tǒng)由一個配有真空脫氣裝置的四級低壓混合泵和一個帶有溫控的托盤和色層分析柱加熱器的自動取樣器組成。色譜分離用Hypersil?金柱（內(nèi)徑50 mm× 2.1 mm，粒徑1.9 μm）結(jié)合同一類型的保護(hù)柱（內(nèi)徑10 mm×2.1 mm，粒徑3 μm）完成。梯度洗脫程序用含0.1%冰醋酸的水-甲醇流動相進(jìn)行。LC柱流出物被接入到TSQ?Quantum Ulta三重四極質(zhì)譜儀中，該質(zhì)譜儀配備有加熱的電噴射離子化（heated Electro spray Ionization，h-ESI）探針，可在負(fù)離子化模式下操作。隨后對選擇反應(yīng)監(jiān)測（Selected Reaction Monitoring，SRM）轉(zhuǎn)換進(jìn)行監(jiān)測，并用于識別和量化，分別為：DONM/Z 355.1>265.2和355.1> 295.1，為DOM-1M/Z 339.1> 459.1和339.1> 249.0和13C15-DONM/Z 370.1> 279.2和370.1> 310.1。DON和DOM-1的定量極限（Limit Of Quantification，LOQ）分別為1 μg/mL和2 μg/mL，而檢測極限（Limit Of Detection，LOD）分別為0.05 ng/mL和0.04 ng/mL。

2.4 吸收參數(shù)

用WinNonlin6.3（Pharsight公司，美國密蘇里州圣路易斯）軟件對吸收參數(shù)進(jìn)行分析，分別計(jì)算DON的最重要參數(shù)：最大血漿濃度（Cmax），口服后到血漿中DON達(dá)到最高濃度的時間（Tmax），處于血漿濃度-時間曲線下方從口服DON時起至無窮大時間之間的面積（AUC0-inf），吸收速率常數(shù)（ka），吸收半反應(yīng)期（T1/2a），消除速率常數(shù)（kel），消除半反應(yīng)期（T1/2el），口服活量的平均分配容積（Vd/F）和口服量的平均解除速率（Cl/F）。

3 結(jié)論

本研究是動物營養(yǎng)界有史以來第一次利用體內(nèi)模型根據(jù)霉菌毒素吸收動力學(xué)來評價活性炭對豬口服嘔吐毒素的解毒效率。結(jié)果表明活性炭能夠完全防止DON從腸道進(jìn)入豬體內(nèi)。

原題名：Efficacy of Active Carbon towards the Absorption of Deoxynivalenol in Pigs（英文）

原作者：Mathias Devreese、Gunther Antonissen、Patrick De Backer和SiskaCroubels