楊子琴　陳星星　張蕾　洪繼旺　陳業(yè)淵　李松剛

摘 要 以儲(chǔ)良龍眼為試材，通過(guò)分析低溫誘導(dǎo)、氧化脅迫、自然低溫+藥劑處理龍眼成化過(guò)程中氧化損傷各指標(biāo)變化，研究龍眼成花和氧化脅迫之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，氧化脅迫有利于龍眼成花。對(duì)頂芽和葉片活性氧、抗壞血酸和丙二醛（MDA）含量的檢測(cè)結(jié)果也表明，氧化脅迫誘導(dǎo)龍眼成花的同時(shí)，也導(dǎo)致了龍眼樹(shù)各組織活性氧的累積，且抗壞血酸抑制龍眼成花，MDA促進(jìn)龍眼成花。因此認(rèn)為活性氧與龍眼成花呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞 龍眼；成花；氧化損傷；活性氧；丙二醛；抗壞血酸

中圖分類號(hào) S667.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Relationship Between Longan Flower and Oxidative Damage

YANG Ziqin1， CHEN Xingxing2， ZHANG Lei1， HONG Jiwang1， CHEN Yeyuan1 *， LI Songgang1 *

1 Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Tropical Crops Genetic

Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， National Cultivar Improvement Center of

Tropical Fruit Tree， Danzhou，Hainan 571737， China

2 Henan Vocational College of Agriculture， Zhengzhou， Henan 451450， China

Abstract Low temperature induced， oxidative stress， natural low temperature combined with medicament spraying were used to study the correlation between longan-flowering and oxidative stress. Results indicated that oxidative stress induced longan flower， and led to the accumulation of reactive oxygen in parts of longan tree organizations， while ascorbic acid inhibited longan flower， MDA promoted longan flower. It confirmed there was a positive correlation between longan flower and active oxygen.

Key words Longan； Flower； Oxidative damage； Reactive oxygen species； MDA； Ascorbic acid

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.020

花芽分化標(biāo)志著植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化。經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在植物與環(huán)境的互作中適當(dāng)?shù)拿{迫往往促進(jìn)開(kāi)花，如適當(dāng)?shù)臄喔透珊得{迫有利于柑桔成花[1]；低溫、氧化脅迫、甚至嫁接不親和都能誘導(dǎo)龍眼果樹(shù)的成花[2-4]；干旱脅迫誘導(dǎo)枇杷[5]的成花；高溫脅迫可誘導(dǎo)水仙花FT-like NFT1基因高量表達(dá)[6]；干旱脅迫造成了擬南芥中包括FLOWER LOCUS T（FT）基因在內(nèi)的4 153個(gè)成花相關(guān)基因差異表達(dá)[7]。脅迫條件的發(fā)生同時(shí)伴隨著活性氧的累積，低溫可使荔枝花芽的H2O2含量升高，相對(duì)電導(dǎo)率增大，對(duì)冷敏性強(qiáng)的荔枝會(huì)造成氧化脅迫與活性氧產(chǎn)生/清除的平衡失調(diào)[8]，植物的防御系統(tǒng)在低溫逆境條件下會(huì)被破壞，導(dǎo)致活性氧大量積累，進(jìn)而造成生物膜的嚴(yán)重?fù)p害[9]。外施H2O2和NO促進(jìn)劑可以誘導(dǎo)蝴蝶蘭花器官中游離氧離子的濃度增加，進(jìn)而增加氧化損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化及SOD、APX和非特異性過(guò)氧化物酶（POD）的活性，同時(shí)造成過(guò)氧化氫酶（CAT）和GR的活性降低[10]。

Lokhande[11]等發(fā)現(xiàn)H2O2是誘導(dǎo)擬南芥開(kāi)花的一個(gè)因子。低溫脅迫可誘導(dǎo)荔枝混合花芽中H2O2和NO含量上升；H2O2和NO發(fā)生劑硝普鈉和百草枯處理同樣增加荔枝混合花芽中NO和H2O2含量，促進(jìn)抽生純花芽。NO合酶抑制劑L-NNA和H2O2清除劑DMTU抑制荔枝成花，這間接證明H2O2和NO對(duì)荔枝成花有調(diào)控作用[12]。而有相反的報(bào)道認(rèn)為，NO供體硝普鈉的應(yīng)用導(dǎo)致擬南芥開(kāi)花延遲，通過(guò)遺傳篩選發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體具有高或低的內(nèi)源性NO水平，從而延遲或提早開(kāi)花；高濃度的NO抑制花分生組織中LFY基因的表達(dá)和CO基因?qū)Τ苫ǖ拇龠M(jìn)作用；此外，增加了成花限制基因FLC的表達(dá)[13]。但是，這些脅迫信號(hào)分子與成花之間的作用機(jī)理目前尚不明確。對(duì)于龍眼而言，低溫及氧化脅迫究竟引發(fā)了怎樣的生理變化，這些信號(hào)物質(zhì)是如何參與龍眼成花的誘導(dǎo)，從而開(kāi)啟開(kāi)花程序并關(guān)閉營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的程序還尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為8年生的石硤龍眼（Dimocarpus longan Loureiro），試材均常規(guī)管理。

1.2 方法

試驗(yàn)材料包含3種處理方式龍眼果樹(shù)。人工低溫誘導(dǎo)采用8～10 ℃（12 h）/18～22 ℃（12 h），光照模擬自然光，在末次冬梢成熟后進(jìn)行人工低溫誘導(dǎo)，脅迫后42 d側(cè)花原基形成。低溫誘導(dǎo)試驗(yàn)系統(tǒng)以單株為實(shí)驗(yàn)單元，設(shè)5次重復(fù)。每隔7 d采集樣品1次，采集的樣品包含葉片與頂芽。

氧化脅迫采用的龍眼樹(shù)在正造季節(jié)摘除花序，在新梢抽生3次后進(jìn)行催花，催花藥劑為：土施氯酸鉀+氯化鉀誘導(dǎo)成花（W氯酸鉀 ∶ W氯化鉀=6 ∶ 4，

0.5 kg/m樹(shù)冠直徑），催花后28 d側(cè)花原基形成。氧化脅迫試驗(yàn)以單株為試驗(yàn)單元，設(shè)5次重復(fù)。每隔7 d采集樣品1次，采集的樣品包含葉片與頂芽。

藥劑處理：對(duì)冬季自然低溫龍眼樹(shù)末次冬梢成熟后20 d的梢芽噴施藥劑，以單株為試驗(yàn)單元，設(shè)5次重復(fù)。每個(gè)藥劑處理每株樹(shù)噴施15個(gè)枝梢，每天采集樣品1次，直至側(cè)花原基形成，采集的樣品為頂芽。藥劑處理包含：脫落酸（ABA）100 mg/L；ABA阻斷劑，鎢酸鈉（Sodium tungstate dihydrate， STD）5 mmol/L；H2O2清除劑，二甲基硫脲（DMTU）1 g/L；H2O2發(fā)生劑，百草枯（MV）20 mg/L；NO發(fā)生劑，硝普鈉（SNP）0.1 mmol/L；NO合酶抑制劑，（L-NNA） 0.1 mmol/L；以噴施水為對(duì)照。噴施方式為枝梢噴施，噴施至滴水。

活性氧檢測(cè)采用DAB染色法：將需要檢測(cè)的組織浸泡于DAB染液中（1 mg/mL，pH5.8）28 ℃避光保存8 h；倒棄染液，80%乙醇沸浴2 min，重復(fù)2次；用無(wú)水乙醇沸浴至顏色不變；倒棄液體，再浸泡于無(wú)水乙醇中于4 ℃保持4 h后觀測(cè)并拍照，活性氧含量越高則顏色越深。

抗壞血酸含量采用高俊鳳的方法[14]測(cè)定。

MDA含量采用硫代巴比妥酸法[15]測(cè)定。

抗壞血酸、MDA含量均以樣品鮮重（FW）為基數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS16.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化脅迫對(duì)成花過(guò)程中龍眼各部分活性氧分布的影響

DAB染色結(jié)果（圖1）顯示：氧化脅迫導(dǎo)致龍眼樹(shù)體各組織出現(xiàn)不同程度的活性氧累積；隨著龍眼成花進(jìn)程的推進(jìn)，活性氧累積也在加重。尤以頂芽、老莖髓部及韌皮部積累活性氧最多，嫩莖積累活性氧次之。氧化脅迫對(duì)葉片活性氧累積影響不大。

2.2 龍眼成花與抗壞血酸含量的關(guān)系

抗壞血酸在植物體遭遇逆境時(shí)具有重要的抗氧化作用，而逆境中抗壞血酸含量越高，植物體逆境傷害就會(huì)越輕。在整個(gè)花芽形成過(guò)程中，龍眼葉片的抗壞血酸含量（W抗壞血酸）遠(yuǎn)低于頂芽（圖2）。在枝梢成熟后0 d，葉片抗壞血酸含量為2.83 mg/g，直至側(cè)花原基形成之前都在此水平上下波動(dòng)；至側(cè)花原基形成時(shí)才上升至4.71 mg/g，并在隨后的1周內(nèi)迅速下降。而頂芽中的抗壞血酸含量在枝梢剛成熟時(shí)雖僅有4.92 mg/g，但隨后7 d內(nèi)上升至8.42 mg/g，并在枝梢成熟14 d時(shí)上升至最高峰（8.93 mg/g）；在枝梢成熟后28 d頂芽抗壞血酸含量降到低谷（5.20 mg/g），在側(cè)花原基形成時(shí)頂芽中抗壞血酸含量再次上升至峰值（8.38 mg/g）。

氧化脅迫龍眼頂芽的抗壞血酸含量也遠(yuǎn)高于葉片（圖3）。催花對(duì)葉片中抗壞血酸含量影響不大，催花之初為2.24 mg/g，隨后僅有小幅上升，并在小范圍內(nèi)波動(dòng)（2.48～3.16 mg/g）；頂芽中抗壞血酸含量在催花之初較高，達(dá)到9.91 mg/g，而在催花后下降，并在7 d中跌至低谷（6.07 mg/g），隨后又緩慢上升，側(cè)花原基形成時(shí)達(dá)到7.02 mg/g。

2.3 龍眼成花與MDA含量的關(guān)系

MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一；MDA產(chǎn)生數(shù)量的多少，代表細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度，可間接反映植物組織受傷的程度。除了個(gè)別時(shí)段（枝梢成熟后14 d）以外，低溫誘導(dǎo)龍眼枝梢成熟后的葉片MDA含量CMDA均高于頂芽（圖4）。在枝梢成熟后0 d，葉片中MDA含量為16.83 nmol/g，頂芽中MDA含量為14.45 nmol/g；枝梢成熟后7 d，葉片中MDA含量出現(xiàn)小幅下降（12.67 nmol/g），并維持該水平直至枝梢成熟后42 d（此時(shí)為側(cè)花原基形成時(shí)），MDA含量上升至36.73 nmol/g，隨后下降到枝梢成熟時(shí)水平；頂芽中MDA含量變化除枝梢成熟后14 d時(shí)出現(xiàn)1個(gè)高峰（26.80 nmol/g）外，在整個(gè)花芽形成階段均徘徊在10.44～16.10 nmol/g。

在催花之后，龍眼葉片和頂芽的MDA含量均出現(xiàn)了2次高峰（圖5）。其中，葉片的高峰分別出現(xiàn)在催花后0 d（21.35 nmol/g）和21 d（18.98 nmol/g），其他階段均在14.22～17.12 nmol/g內(nèi)波動(dòng)；頂芽的高峰分別出現(xiàn)在催花后14 d（25.06 nmol/g）和28 d（21.98 nmol/g），其他階段均在14.02～16.53 nmol/g范圍內(nèi)。在整個(gè)氧化脅迫成花過(guò)程中，除了頂芽出現(xiàn)2次高峰的時(shí)間外，其余時(shí)間均以葉片的MDA含量最高。

為了弄清楚活性氧及其上下游產(chǎn)物對(duì)龍眼成花的作用，本研究采用了信號(hào)清除劑及阻斷劑處理，以期探明活性氧損傷在龍眼成花中的確切作用。這些信號(hào)類藥劑對(duì)頂芽MDA含量的影響差別很大（圖6）：在噴藥1 d后，DMTU和SNP處理的MDA含量上升最多，分別達(dá)到62.88和32.74 nmol/g，其它各處理略高于對(duì)照水平（14.97 nmol/g）；噴藥3 d后，又回復(fù)到處理之前的水平；噴藥5 d后，仍然以SNP處理的MDA含量最高，達(dá)到34.54 nmol/g，DMTU、MV、L-NNA的MDA含量也略高于對(duì)照水平，而STD和ABA處理卻導(dǎo)致了頂芽MDA含量低于對(duì)照水平；噴藥7 d后，除了STD和ABA處理外其它各處理均達(dá)到了前所未有的MDA含量水平，STD和ABA處理分別為16.23和18.03 nmol/g，SNP、DMTU、MV和L-NNA的MDA含量依次為47.04、70.58、40.93、46.62 nmol/g。

3 討論與結(jié)論

3.1 活性氧與龍眼成花的關(guān)系

活性氧信號(hào)在調(diào)節(jié)植物發(fā)育和應(yīng)對(duì)脅迫反應(yīng)方面具有重要作用，但關(guān)于活性氧如何調(diào)節(jié)花芽分化的報(bào)道很少。作為比較穩(wěn)定的一種活性氧信號(hào)分子，H2O2可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控許多生理過(guò)程，包括產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉、誘發(fā)過(guò)敏性反應(yīng)等[16]。Lokhande等[11]發(fā)現(xiàn)，擬南芥開(kāi)花前的抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性越高則開(kāi)花越遲，氧化脅迫越強(qiáng)開(kāi)花早，即抗壞血酸含量越低，開(kāi)花越早，抗壞血酸與開(kāi)花呈負(fù)相關(guān)，這與本試驗(yàn)結(jié)論相同。對(duì)于低溫脅迫誘導(dǎo)龍眼成花，葉片中抗壞血酸在側(cè)花原基形成時(shí)含量上升的原因可能是葉片在此階段已不需要過(guò)多的活性氧來(lái)促進(jìn)花芽形成，而過(guò)多的活性氧在側(cè)花原基形成之后阻礙了花序的抽生。頂芽是龍眼花芽分化的發(fā)生部位，在遭遇冷脅迫之后，應(yīng)激性的抗壞血酸含量上升是緩沖頂芽對(duì)氧化損傷的反應(yīng)。而后頂芽啟動(dòng)花芽分化則需要活性氧的累積，抗壞血酸出現(xiàn)下降，并在側(cè)花原基形成之后繼續(xù)起到抑制頂芽氧化傷害的作用。氧化脅迫較低溫脅迫所產(chǎn)生的氧化損傷更為直接，作用部位直接在頂芽組織上，對(duì)葉片的影響不大，這與活性氧在龍眼各組織中的分布互相印證。頂芽中抗壞血酸含量的下降預(yù)示著氧化脅迫所產(chǎn)生的活性氧將更多的累積于頂芽而無(wú)抑制因素的參與。這使得氧化脅迫誘導(dǎo)成花周期較低溫誘導(dǎo)更短。這與低溫誘導(dǎo)龍眼在末次冬梢成熟后42 d形成側(cè)花原基，而氧化脅迫龍眼在催花之后28 d形成側(cè)花原基互為佐證。

3.2 MDA、抗壞血酸與龍眼成花的關(guān)系

MDA與抗壞血酸所表示的氧化損傷意義恰恰相反，如葉片抗壞血酸含量低于頂芽，葉片MDA含量高于頂芽。低溫脅迫初期頂芽MDA曾一度高于葉片，可能是啟動(dòng)側(cè)花原基的標(biāo)志，而后期葉片MDA在側(cè)花原基形成前后的爆發(fā)可能是因?yàn)轫斞炕钚匝醯南陆担沟萌~片活性氧向頂芽極性運(yùn)輸所致。NO是動(dòng)物細(xì)胞重要的第二信使，但更多的試驗(yàn)表明，它同時(shí)也是植物細(xì)胞中一種重要的信號(hào)分子，在超氧陰離子的配合下信號(hào)分子NO可以轉(zhuǎn)變成具有毒性的亞硝酸根陰離子[17-19]，NO作為信號(hào)分子與活性氧協(xié)同作用啟動(dòng)植物的應(yīng)逆反應(yīng)[20]。Zafra等[21]發(fā)現(xiàn)油橄欖成花過(guò)程有賴于H2O2和NO的參與。本試驗(yàn)中NO促進(jìn)劑噴施導(dǎo)致龍眼頂芽MDA含量升高，對(duì)龍眼頂芽的損傷較大，但卻促進(jìn)了龍眼早花的出現(xiàn)，這與Zafra的結(jié)論相同。

綜上所述，氧化損傷與龍眼成花呈正相關(guān)，抗壞血酸抑制龍眼成花，而MDA促進(jìn)龍眼成花。

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