田萬年　鐘寶

摘要 [目的]探討籠養(yǎng)花尾榛雞的遺傳分化。[方法]采用PCR和DNA直接測序技術(shù)測定線粒體細胞色素Cyt b基因全序列，結(jié)合GeneBank收錄的其他松雞科同源序列，利用生物學(xué)軟件進行分析。[結(jié)果]15只花尾榛雞樣本Cyt b基因序列中，共檢測到核苷酸多態(tài)位點12個，具有6種單倍型，籠養(yǎng)吉林花尾榛雞遺傳多樣性水平較低。系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，吉林花尾榛雞與松雞科榛雞屬親緣關(guān)系最近，與北美榛雞屬親緣關(guān)系較遠。[結(jié)論] 花尾榛雞屬于松雞科榛雞屬，不應(yīng)并入北美榛雞屬。

關(guān)鍵詞 花尾榛雞；Cyt b基因；遺傳多樣性

中圖分類號 S864.3 文獻標(biāo)識碼A 文章編號 0517-6611（2015）11-030-02

花尾榛雞（Bonasa bonasia）是雞形目雉科鳥類，俗稱飛龍，是東北地區(qū)典型的森林留鳥[1]。其在東北曾有大規(guī)模的分布，長期以來，因狩獵致使數(shù)量下降而成為國家Ⅱ級保護鳥類。目前國內(nèi)對其飼養(yǎng)繁育及疾病等方面進行了較為深入的研究，但有關(guān)花尾榛雞的分子生態(tài)學(xué)方面研究尚未見報道。線粒體DNA（mtDNA）具有母性遺傳、進化速率快、拷貝數(shù)多的特點，是目前生物體研究中應(yīng)用最廣泛的遺傳標(biāo)記之一。 細胞色素b（Cyt b）是mtDNA編碼的呼吸鏈上重要的酶之一，作為一種高效的母系遺傳標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育研究[2]。筆者以分子生態(tài)學(xué)研究中使用最為普遍的mtDNA的控制區(qū)和細胞色素b（Cyt b）作為分子標(biāo)記，對花尾榛雞的遺傳多樣性進行分析，以期為制定科學(xué)的繁育計劃、對花尾榛雞進行遺傳保護提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集吉林花尾榛雞來自吉林市左家珍禽養(yǎng)殖場，采集不同個體花尾榛雞抗凝血15份，置于冰瓶帶回實驗室，-20 ℃保存?zhèn)溆?。用全血基因組提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2 Cyt b基因的擴增和序列測定根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的松雞基因序列（AB120132），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計一對引物。上游引物P1： 5'-ATG GCA CCC AAC ATC CGA AAA T-3'，下游引物P2：5'-TTA GTG GTT GAG TAT TTT GTT T -3'，預(yù)期擴增大小為1 143 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s， 52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物的純化、回收和測序由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計分析 應(yīng)用Clustal W（1.82）軟件進行多序列比對，通過MEGA4.0 軟件計算不同序列間的核苷酸代替、變異位點、轉(zhuǎn)換顛換比率及遺傳距離等。用DNAsp4.10軟件計算單倍型、單倍型多樣性、核苷酸多樣性。利用MEGA 軟件計算品種間距離，利用UPGMA 法構(gòu)建品種的分子系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 花尾榛雞Cyt b基因PCR擴增結(jié)果通過DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和測序結(jié)果得知，Cyt b基因PCR產(chǎn)物大小為1 143 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 花尾榛雞Cyt b基因的核苷酸多態(tài)位點的突變類型通過對15條花尾榛雞Cyt b基因序列（15條序列由該試驗測定，其余11條序列來源于GenBank）分析結(jié)果表明，所有序列全長均為1 143 bp，無插入和缺失，共發(fā)現(xiàn)12個變異位點，包括9個轉(zhuǎn)換和3個顛換。核苷酸的替換位點主要以轉(zhuǎn)換為主，表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)換偏倚。12個變異位點定義了6種單倍型。

2.3 花尾榛雞Cyt b基因系統(tǒng)進化分析利用Clustal W（1.82）軟件對花尾榛雞mtDNA Cyt b序列進行同源序列對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15只花尾榛雞 Cyt b 基因全序列由6種單倍型組成。結(jié)合所有的群體單倍型序列，并引用GenBank中的部分松雞科Cyt b基因序列，采用UPGMA法，以Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出，基于Cyt b基因吉林花尾榛雞與榛雞屬Tetrastes bonasia（NC-020591）親緣關(guān)系最近，與斑尾榛雞（AF230166）處于一個分支，而北美榛雞屬（AF230167）單獨處于一個分支。黑琴雞（AF230166）、松雞（AF230179）和巖雷鳥（AY156346）共在一個分支上。

3 討論

花尾榛雞的肉質(zhì)口感細嫩，肉味極其鮮美且具有良好的滋補作用和扶正固本的藥效，具有非常高的經(jīng)濟價值[3]。近年來由于對花尾榛雞棲息地環(huán)境破壞及大量捕獵，花尾榛雞的野生數(shù)量急劇減少。目前， 我國關(guān)于花尾榛雞的研究主要集中在人工馴養(yǎng)和養(yǎng)殖、疾病防治、飼料及營養(yǎng)、人工孵化及育雛等方面[4-8]。 研究手段較單一，研究深度不夠，繁殖率低、幼雛成活率低等問題尚未能解決。因此，對花尾榛雞的遺傳、生理及進化等方面進行系統(tǒng)的研究為花尾榛雞的保

護及生產(chǎn)利用提供有效的保證。目前，對于花尾榛雞種群遺傳多樣性分析研究較少。楊秀芹等[9]對花尾榛雞MC4R基因進行了克隆和序列分析。蔡曉淇[3]對花尾榛雞的系統(tǒng)地位與BLB基因多態(tài)性進行了研究。該試驗測定和分析了吉林地區(qū)花尾榛雞15只樣本的mtDNA Cyt b基因序列，共檢測到12個多態(tài)位點，定義了6種單倍型。

目前我國對松雞科鳥類的種屬分類存在爭議，最早認(rèn)為劃分為9屬。國內(nèi)學(xué)者通過形態(tài)、分子系統(tǒng)學(xué)等方法認(rèn)為應(yīng)將劃分為7屬或6屬。對于花尾榛雞的分類地位主要集中北美榛雞屬Bonasia 和榛雞屬Tetrastes。該試驗通過測定花尾榛雞mtDNA Cyt b基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，籠養(yǎng)吉林花尾榛雞與榛雞屬Tetrastes bonasia（NC-020591）親緣關(guān)系最近，與斑尾榛雞（AF230166）處于一個分支，而北美榛雞屬（AF230167）單獨處于一個分支。該研究支持花尾榛雞屬于松雞科榛雞屬，不應(yīng)并入北美榛雞屬，與包新康等[4]、蔡曉淇等[10]的觀點一致。

參考文獻

[1]朱井麗.長白山東部山區(qū)越冬期花尾榛雞種群密度及分布[J].黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院學(xué)報，2011，24（3）：24-25.

[2] 劉向華，王義權(quán)，劉忠權(quán)，等.從Cytb基因序列探討鹿亞科動物的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[J].動物學(xué)研究，2003，24（1）：27-33.

[3] 蔡曉淇.花尾榛雞的系統(tǒng)地位與BLB基因多態(tài)性研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2013.

[4] 包新康，劉發(fā)，顧海軍，等.雞形目鳥類系統(tǒng)發(fā)生研究現(xiàn)狀[J].動物分類學(xué)報，2008，33（4）：720-732.

[5] 趙匠，易國棟，郝錫聯(lián)，等.珍禽花尾榛雞的研究現(xiàn)狀及展望[J].吉林師范大學(xué)學(xué)報，2006（2）： 60-61.

[6] 李愛國，李國君.花尾榛雞野生馴養(yǎng)方法[J].特種經(jīng)濟動植物，2009（10）：8-9.

[7] 杜繼紅，周玉秋.花尾榛雞的養(yǎng)殖[J].中國禽業(yè)導(dǎo)刊，2006，23（18）：31-32.

[8] 孫淑霞，薛茗元，張克勤.花尾榛雞人工飼養(yǎng)技術(shù)[J].中國家禽，2014，36（6）：55-58.

[9] 楊秀芹，張冬杰，劉娣.環(huán)頸雉和花尾榛雞MC4R基因的克隆和序列分析[J].中國畜牧雜志，2010，46（17）：16-18.

[10] 蔡曉淇，白素英，金煜.松雞科13種鳥類COⅠ序列變異及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].動物分類學(xué)報，2012，37（2）：269-273.