龍翔宇　何斌　王闖　胡彥師　秦云霞　方永軍　唐朝榮

摘 要 本研究采用核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）標(biāo)記分析37份橡膠樹1981IRRDB野生種質(zhì)以及7份栽培品系的遺傳多樣性及其進(jìn)化關(guān)系，擬在DNA序列水平上了解野生種質(zhì)及栽培品系的遺傳背景，為保護(hù)、發(fā)掘和利用現(xiàn)有橡膠樹種質(zhì)資源提供遺傳理論依據(jù)。在44份材料中，9份資源種質(zhì)及1份栽培品系出現(xiàn)ITS基因雜合子現(xiàn)象，ITS序列長度在583～588 bp之間，G+C含量65.52%～67.17%，共有87個變異位點。ITS核苷酸多樣性Pi值為0.011 6，其中ITS2的Pi值（0.014 33）明顯高于ITS1（0.010 10）及5.8S（0.010 31），表明ITS2序列具有更快的進(jìn)化速率，更合適于橡膠樹遺傳多樣性及系統(tǒng)學(xué)研究。在34個單倍型中，單倍型H8位于網(wǎng)絡(luò)圖的中心，為最古老的高頻單倍型，其遺傳背景主要來自朗多尼亞州。NJ分子系統(tǒng)樹顯示大部分栽培品系（熱研7-20-59，RRIM600，熱研7-33-97，熱墾628，熱研88-13）與朗多尼亞州（Rodo^nia）部分種質(zhì)具有相似的遺傳背景。此外，中性檢測及單倍型網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果暗示本研究材料曾經(jīng)經(jīng)歷一個擴(kuò)張的歷史事件。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；野生種質(zhì)；栽培品系；ITS序列；遺傳多樣性

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Genetic Diversity and Phylogenetic Evolution Among 1981IRRDB

Wild Germplasm and Cultivars Using ITS

Markers in Rubber Tree

LONG Xiangyu1， HE Bin2， WANG Chuang2， HU Yanshi1，

QIN Yunxia1， FANG Yongjun1， TANG Chaorong1 *

1 Rubber Research Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China

2 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Using internal transcribed spacer（ITS）mark technology， 44 rubber trees including 37 wild germplasm of 1981IRRDB and 7 cultivars were used to investigate the genetic diversity and phylogenetic evolution. Nine wild germplasms and one cultivar presented heterozygosis of ITS sequence. The sequence length was 583-588 bp， and the G+C content was 65.52%-67.17%. There were 87 variable sites in the ITS sequence， and the nucleotide diversity of ITS2（0.014 33）was higher than that of ITS1（0.010 10）and 5.8 S（0.010 31）， showing that ITS2 was a more suitable choice for genetic diversity and phylogenetic evolution. Haplotype analysis showed that H8 was an older and more frequent haplotype， and located in the center of the network graph. Five cultivars and parts of the wild germplasms from Rodo^nia had similar genetic background， and cultivars included Reyan7-20-59， RRIM600， Reyan 7-33-97， Reken 628 and Reyan 88-13. In addition， neutral test and network of haplotype implied that the trees had gone through an event of population expansion.

Key words Rubber tree； Wild germplasm； Cultivar； ITS sequence； Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.001

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis），屬大戟科，橡膠樹屬高大喬木，是一種在世界經(jīng)濟(jì)和軍事發(fā)展中均扮演重要角色的熱帶樹種，其生產(chǎn)的天然橡膠是一種重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資。目前，中國天然橡膠的消費量逐年增加，而中國天然橡膠的產(chǎn)量不及消費量的1/5，需求缺口逐年加大[1]。中國適宜種植橡膠的面積有限，實際種植面積已達(dá)極限，已經(jīng)沒有擴(kuò)大種植面積來增加產(chǎn)量的空間，大幅度提高橡膠樹單位面積產(chǎn)量是一條適合中國橡膠事業(yè)發(fā)展和緩解天然橡膠供需矛盾壓力的可行性途徑。雜交育種一直是橡膠樹產(chǎn)量育種的常規(guī)方法，然而種質(zhì)資源的匱乏，特別是狹窄的遺傳基礎(chǔ)勢必制約橡膠樹良種培育和產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此，世界各植膠國均認(rèn)識到橡膠樹種質(zhì)資源材料的收集及評價的重要意義[2-3]。

評價種質(zhì)資源材料遺傳多樣性有助于種質(zhì)資源的保存及利用。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于橡膠樹遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定等研究[4]，如RAPD[5]，EST-SSR[6-7]，RFLP[8]，AFLP[9]，SNP等[10]。在眾多分子標(biāo)記中，核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer， ITS）是位于核糖體DNA（rDNA）上18 S和28 S之間的區(qū)域片段，主要包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1）、5.8S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）。ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)，承受的進(jìn)化選擇壓力較小，相對變化較大，可以提供豐富的信息位點，目前被廣泛應(yīng)用于植物進(jìn)化與系統(tǒng)分析[11-15]，而ITS標(biāo)記在橡膠樹中的應(yīng)用未見報道。

本研究利用ITS序列分子標(biāo)記技術(shù)，對37份1981IRRDB種質(zhì)，以及7份栽培品系，共44份橡膠樹材料的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，擬在DNA序列水平上探討種質(zhì)資源以及栽培材料之間的進(jìn)化關(guān)系和遺傳背景，為橡膠樹種質(zhì)資源的保護(hù)與利用及橡膠樹遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

44份供試橡膠樹材料收集于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國家橡膠樹種質(zhì)資源圃，其中包括37份1981IRRDB種質(zhì)，種質(zhì)主要來源于巴西亞馬遜河流區(qū)域阿克里州（Acre），馬托格羅索州（Mato Grosso）和朗多尼亞州（Rodo^nia）3個州，以及7份栽培品種（RRIM600，PR107，熱墾628，熱研7-33-97，熱研88-13，熱研7-20-59，93-114）（表1）。2014年6月，采集幼嫩葉片液氮凍存帶回實驗室備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及質(zhì)量檢測 取冷凍保存的植物葉片，采用新型植物基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司，DP320）提取葉片DNA，并利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳及微量紫外分光光度計（Thermo Scientific，Nanodrop 2000）檢測DNA濃度與純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ITS區(qū)PCR擴(kuò)增 根據(jù)EBI（European Bioinformatics Institute）橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫提供的ITS序列設(shè)計2對擴(kuò)增引物，分別為ITSa（ITSaF： 5′-ACG TCG CGA GAA GTC CAT TGA ACC TT-3′，ITSaR： 5′-CCG ATT CTC AAG CTG GGC TCT TCC C-3′）和ITSb（ITSbF： 5′-GAG GAA GGA GAA GTC GTA ACA AAG TTT CCG T-3′，ITSbR 5′-GCT GAG GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT-3′），2對引物擴(kuò)增相同ITS序列，引物由上海英俊生物工程技術(shù)有限公司合成。以44份材料DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25，2.5 μL 10×HiFi Buffer I（含Mg2+），2.5 mmol dNTPs 2 μL，1 U HiFi DNA polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司，Trans Tap TM DNA Polymerase High Fidelity），0.5 μmol引物和50 ng模板DNA。反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，68 ℃退火延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，利用ChemiDocXRS+（Bio-Rad）成像系統(tǒng)觀察和拍照記錄。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化、克隆與測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒（美國OMEGA）純化回收后，連接pMD18-T載體（TaKaRa公司）并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)JM109（本實驗室保存），LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)菌斑檢測后，每份材料選取5個陽性克隆送至上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DNAMAN 6.0.3.99軟件分析測序結(jié)果，確定ITS序列范圍，除去兩端非ITS序列部分。利用DnaSP 5.10.00軟件分析個體G+C含量，變異位點數(shù)（Variable，Vs），單倍型數(shù)目（Number of haplotypes，h），單倍型多樣性（Haplotype diversity，Hd），核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，Pi），單倍型多樣性方差（Variance of haplotype divversity，Vh），單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差（Standard deviation of haplotype diversity，Sh）以及中性檢測（Tajima's D和Fu's Fs）等遺傳多樣性指標(biāo)進(jìn)行計算。采用Mega 5.05軟件分析個體間的遺傳距離，并通過自展分析（bootstrap）做置信度檢測，自展數(shù)據(jù)集為1 000次，鄰接法（Neighbor-joining）獲得系統(tǒng)發(fā)育樹。運用NetWork ver 4.6.1.2軟件中介鄰接網(wǎng)絡(luò)（Median-Joinging network， MJ）算法構(gòu)建ITS單倍型間關(guān)聯(lián)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試橡膠樹材料的ITS序列特征

本研究利用ITS引物對37份橡膠樹種質(zhì)資源材料及7份栽培材料rDNA-ITS區(qū)（包括部分18 S rDNA、ITS1、5.8 S rDNA、ITS2和部分26 S rDNA）進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序，去除18 S rDNA及26 S rDNA序列，最終得到54條ITS序列。在44份材料中，9份種質(zhì)資源材料（80、84、92、93、94、101、104、109和122）以及1份栽培材料（熱研7-33-97）出現(xiàn)了ITS基因雜合子現(xiàn)象（a，b代表2個雜合子）。DnaSP軟件分析表明，ITS序列長度在583～588 bp之間，G+C含量65.52%～67.17%（ITS1：長度223～228 bp，G+C含量65.18%～69.64%；5.8 S：長度162～165 bp，G+C含量54.27%～57.93%；ITS2：長度194～198 bp，G+C含量71.28%～74.87%）（表2）。其中材料94的ITS序列最長（588 bp），其次為熱研7-33-97（586 bp），G+C含量最高的材料為88（67.18%），G+C含量最低的材料為122（65.52%）。

2.2 供試橡膠樹材料的ITS核苷酸多樣性和單倍型信息

進(jìn)一步分析供試材料ITS序列，該序列存在87個變異位點（單變異位點57個），其中ITS1存在30個變異位點（單變異位點23個），ITS2存在34個變異位點（單變異位點19個），5.8 S存在23個變異位點（單變異位點15個）。除此之外，在ITS區(qū)檢測到插入缺失位點共9個，其中ITS1存在6個插入缺失位點，ITS2區(qū)存在3個插入缺失位點，5.8 S區(qū)沒有檢測到插入缺失位點（表3）。ITS核苷酸多樣性Pi值為0.011 60，Theta值為0.034 30，其中ITS1的Pi值為0.010 10，Theta值為0.030 20，ITS2的Pi值為0.014 33，Theta值為0.040 93，5.8 S的Pi值為0.010 31，Theta值為0.032 11。Pi值結(jié)果顯示，變異位點分布相對均勻，ITS2發(fā)生變異略高于ITS1和5.8S（表2）。

根據(jù)ITS核苷酸變異位點，最終確定34個單倍型，其中單倍型H8在供試材料中分布最廣，共8個材料（82、87、109、121、熱墾628、熱研88-13、熱研7-33-97），其次為單倍型14，共6個材料（89、92、95、96、106、123），其余單倍型只分布在少數(shù)個體中，單倍型多樣性Hd為0.964，多樣性方差Vh為0.000 20，多樣性標(biāo)準(zhǔn)差Sh為0.014（表1和表3）。ITS1存在17個單倍型，其單倍型多樣性Hd為0.744（Vh=0.002 50，Sh=0.050）；ITS2存在18個單倍型，其單倍型多樣性Hd為0.752（Vh=0.002 55，Sh=0.051）；5.8 S存在10個單倍型，其單倍型多樣性Hd為0.581（Vh=0.005 21，Sh=0.072）。ITS1與ITS2單倍型多樣性Hd相近，略高于5.8 S單倍型多樣性Hd（表3）。

ITS中性檢驗分析結(jié)果Tajima's D和Fu's Fs均為負(fù)值，且達(dá)到顯著水平，分別為-2.327（p<0.01）和-4.065（p<0.02）（表3）。此外，ITS1和5.8 S的中性檢驗結(jié)果Tajima's D和Fu's Fs同樣呈現(xiàn)負(fù)值，且達(dá)到極顯著水平，ITS2達(dá)到顯著水平。中性檢驗結(jié)果說明ITS遺傳結(jié)構(gòu)偏離中性假說，內(nèi)部存在自然選擇作用，也預(yù)示本研究群體曾經(jīng)經(jīng)歷了一個擴(kuò)張的歷史事件。

2.3 供試橡膠樹材料間的遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用Mega軟件計算供試材料IST遺傳距離，其遺傳距離在0～0.076 cM之間，存在高度的相似性。部分材料之間ITS序列完全相同，遺傳距離為0 cM，此外，材料83與84 b（遺傳距離為0.076 cM），84與109 b（遺傳距離為0.074 cM）之間遺傳距離相對較大。基于ITS之間的同源性，采用鄰接法（Neighbor Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示將44份材料（54條ITS序列）分為5大分支（圖1）：分支Ⅰ包含9個材料，主要來自阿克里州；分支Ⅲ包含材料最多24個，主要來自于朗多尼亞州，此外，還包含了5個栽培品系熱研7-20-59，RRIM600，熱研7-33-97a，熱墾628，熱研88-13；分支Ⅳ包含了6個材料，主要來自馬托格羅索州，其中包含栽培品系熱研7-33-97b；另外2支Ⅱ和Ⅴ的材料相對復(fù)雜，包含了阿克里州，馬托格羅索州和朗多尼亞州3個地區(qū)的部分材料，以及栽培品系PR107，93-114。

2.4 橡膠樹ITS單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖

采用NetWork軟件中介鄰接網(wǎng)絡(luò)算法對橡膠樹44個個體34種單倍型繪制網(wǎng)絡(luò)圖，圖中明顯識別4個主體單倍型（圖2），其余單倍型圍繞主體單倍型呈星狀排列，說明主體單倍型H8，H18，H14，H22相對原始。其中單倍型H8由3份栽培材料（熱墾628，熱研88-13，熱研7-33-97）和5份朗多尼亞州材料共享，單倍型14由3份朗多尼亞州，2份馬托格羅索州和1份阿克里州材料共享，單倍型18由2份馬托格羅索州材料共享，單倍型22僅有1份阿克里州材料。主體單倍型之間僅保留2～3步變異，主體單倍型與其他單倍型之間大部分只保留1～2步變異，僅少數(shù)單倍型之間保留（H8→H9，H8→H25，H14→H12，H14→H7）3～4步變異。此外，單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)一步支持了供試橡膠樹材料鄰接聚類分析結(jié)果，個體之間并沒有完全的依據(jù)采樣地形成分支。

3 討論與結(jié)論

種質(zhì)資源是橡膠樹選育種的基礎(chǔ)，直接影響橡膠樹優(yōu)良品種的選育。目前，中國橡膠樹種質(zhì)資源比較豐富，已保存包括魏克漢種質(zhì)、非魏克漢種質(zhì)、1981IRRDB種質(zhì)和橡膠樹屬的其他種和變種共6 041份[16]。為拓展橡膠樹遺傳基礎(chǔ)，以1981IRRDB種質(zhì)資源為主體，從產(chǎn)量、生長、抗病等主要性狀方面，積極開展種質(zhì)資源的鑒定評價與創(chuàng)新利用研究，并取得一定進(jìn)展[3，17]。

本研究基于ITS序列標(biāo)記法，分析44份橡膠樹材料遺傳多樣性，其有9份種質(zhì)材料以及1份栽培材料存在ITS基因雜合子現(xiàn)象，由于橡膠樹是典型的異花授粉樹種，從而形成遺傳上的高度雜合性現(xiàn)象。在被子植物中，ITS區(qū)域的總長度在500～750 bp之間，ITS1和ITS2序列G+C含量基本一致，反映出協(xié)同進(jìn)化的現(xiàn)象[18]。本研究44份材料的ITS序列長度相對恒定，ITS1、5.8 S和ITS2序列G+C含量存在差異，且ITS2序列G+C含量最高，ITS1序列次之，5.8 S序列G+C含量最低（表2），G+C含量是基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)化中的一個重要因素[19]。

核苷酸多樣性（Pi）和單倍型多樣性（Hd）可以反映ITS序列遺傳多樣性，核酸多樣性分析結(jié)果顯示ITS2的Pi值明顯高于ITS1及5.8 S，其中具有明顯特征的變異位點可作為特異DNA指紋鑒別位點（表2）。而在單倍型多樣性分析中，ITS1與ITS2單倍型多樣性Hd基本相近，且遠(yuǎn)高于5.8 S（表3）。整體而言，ITS2核酸變異水平明顯高于ITS1及5.8 S，表明ITS2具有更快的進(jìn)化速率，因此ITS2更適合于橡膠樹遺傳多樣性及系統(tǒng)學(xué)研究，類似結(jié)果在其他一些植物的研究中也有報道[20-23]。此外，中性檢驗結(jié)果表明ITS遺傳結(jié)構(gòu)偏離中性假說，內(nèi)部存在自然選擇作用，也同時預(yù)示本研究群體曾經(jīng)經(jīng)歷了一個擴(kuò)張的歷史事件。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示單倍型H8位于網(wǎng)絡(luò)圖中心，為最古老的高頻單倍型，各單倍型之間關(guān)系較近，進(jìn)步一證明ITS序列相對保守。

另外，本研究以54條橡膠樹ITS序列構(gòu)建NJ分子系統(tǒng)樹（圖1），在5大分支中，分支Ⅲ包含材料最多，主體單倍型H8和H14均在此分支，主要包含了朗多尼亞州的部分材料，以及5份栽培品系。熱研7-20-59，熱研7-33-97及熱研88-13擁有共同的親本RRIM600，因此共同屬于分支Ⅲ，進(jìn)一步說明它們的遺傳背景主要來自朗多尼亞州[16]。1994年，RFLP標(biāo)記結(jié)果顯示橡膠樹野生種多態(tài)性高于栽培種，朗多尼亞州和馬托格羅索州種質(zhì)多態(tài)性高于阿克里州[24]。另外2個栽培品系PR107和93-114與馬托格羅索州的103材料遺傳距離最近，推測其遺傳背景主要來自馬托格羅索州。

致 謝 本研究所用橡膠樹種質(zhì)及栽培材料均由國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺-國家橡膠樹種質(zhì)資源子平臺提供。

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