趙新宇 王薇茜 蘆澤蘭 黃雷 趙克溫

摘要：為研究KLF5的相互作用蛋白從而深入探索其生物功能，構建了C端帶有FLAG、HA、6xHis三標簽的pOZ-KLF5真核表達逆轉錄病毒栽體。pOZ-KLF5栽體可通過一次轉錄得到雙順反子轉錄單位，即一個轉錄物能表達兩種獨立存在的蛋白質：三標簽融合蛋白KLF5-3xTag和篩選標記——白細胞介素-2受體a（IL-2Ra）。通過偶聯(lián)IL-2Ra抗體的磁珠成功篩選出KLF5-3xTag表達陽性的293T細胞，經(jīng)Western-blot檢測細胞內KLF5-3xTag表達情況及其對293T細胞增殖及周期的影響，發(fā)現(xiàn)KLF5-3xTag能夠促進細胞克隆的形成并使S期細胞增多，且可被已知E3泛素連接酶WWP1降解，與已有報道一致。進一步通過免疫沉淀實驗證明了與KLF5融合的標簽的免疫反應性。該質粒的成功構建為研究KLF5相互作用蛋白及深入探索其生物功能奠定了基礎。關鍵詞：KLF5；雙順反子轉錄；真核表達；三標簽融合蛋白中圖分類號：Q812 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）02-0124-07Construction and Characterizations of pOZ-KLF5 Retroviral PlasmidZHAO Xin-yu， WANG Wei-xi， LU Ze-lan， HUANG Lei， ZHAO Ke-wen*（Department of Pathophysiology， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200025， China）Abstract： To analyze KLF5 interacting proteins and explore the biological functions of KLF5， the eukaryotic expression retroviral plasmid pOZ-KLF5， with the FLAG， HA， 6xHis triple tags at C-terminal， was con?structed. Plasmid pOZ-KLF5 can get a bicistronic transcription unit after once transcription and express two independent proteins： triple-tagged fusion protein KLF5-3xTag and selection marker interleukin-2 receptor a （IL-2Ra）. 293T cells expressing KLF5-3xTag were successfully selected by the magnetic beads coupling IL-2Ra antibody， and the expression of KLF5-3xTag was detected by Western-blot. Then， the proliferation and cell cycle of 293T were tested， and the results indicated that KLF5-3xTag promotes the proliferation of cell colonies and the Gl/S transition.In addition， co-expression of WWP1， a known E3 ligase of KLF5， can decrease KLF5-3xTag protein level， which is consistent with previous reports. Furthermore， immunoprecipi- tation experiment was applied to prove the immunoreaction of the tags. The successful construction of pOZ- KLF5 provides a powerful tool to study the interacting proteins of KLF5 and to explore the biological func?tions of KLF5.Key words： KLF5； bicistronic transcription； eukaryotic expression； triple-tagged fusion protein（Life Science Research， 2015， 19（2）： 124?130）KLF5蛋白是類KtlippeKKriippel-likefactors，KLF）轉錄因子家族的一員，屬于基礎轉錄因子。到冃前為止該家族巳經(jīng)有17個成員被鑒定出來。KLF5又名BETB2（basictranscriptionelement-bindingprotein2）和IKLF（intestine-enrichedKriippel-likefactor），在胚胎發(fā)育、細胞周期、細胞生長與分化、維持細胞干性等生物過程中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)KLF5在人和小鼠的小腸、結腸、胃、胰腺、胎盤、睪丸、骨骼肌、肺、膀胱和子宮等組織中廣泛表達[1-3]。KLF5能與多個基因的GCbox區(qū)域結合從而調控其轉錄。KLF5蛋白C端含有KLFs家族特征性的、可以結合基因組DNA的3個串聯(lián)重復的鋅指（zincfinger，ZF）結構域，在ZF結構域前含有富含脯氨酸的轉錄激活結構域。值得關注的是，KLF5在不同的細胞類型中發(fā)揮的作用不同，已有的研究提示這可能與KLF5的翻譯后修飾有關。KLF5蛋白有不同的翻譯后修飾，包括磷酸化、乙?；?、泛素化和SUMO化修飾，經(jīng)過翻譯后修飾的KLF5可以與不同的蛋白相互作用從而發(fā)揮不同甚至完全相反的功能[4.5]。為了研究KLF5在真核生物不同生理及病理條件下的相互作用蛋A從而深入研究其生物學功能，我們構建了逆轉錄病毒真核表達載體P0Z-KLF5，通過磁珠篩選出陽性克隆，在檢測KLF5生物功能的同時，驗證了與目的蛋白KLF5融合的標簽的免疫反應性。1材料與方法1.1材料大腸桿菌DH5a感受態(tài)（Invitrogen，美國），pOZ-C載體[6]（簡稱pOZ，C端帶有FLAG和HA標簽，Addgene，美國），質粒提取試劑盒（QIAGEN，美國），凝膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒（Tian-gen，中國），XhoⅠ、NotI核酸內切酶、T4DNA連接酶（Takara，日本），LB培養(yǎng)基（Oxoid，英國），X-tremeGENE9轉染試劑（Roche，美國），MG132（Sig-ma，美國），抗FLAG-M2親和凝膠、抗HA親和凝膠（Sigma，美國），抗IL-2Ra抗體（Upstate，美國），Ni-NTA瓊脂糖（QIAGEN，美國），DynabeadsM450（Invitrogen，美國），抗KLF5抗體（Protein-Tecli，美國）c1.2pOZ-KLF5表達載體的構建根據(jù)逆轉錄病毒載體pOZ的多克隆位點，設計帶有XhoI和NotI酶切位點（見斜體）的KLF5擴增引物，在C端PCR引物中引人了6xHis標簽（見下劃線）。引物序列Forward：5（-GGGCrCGAGTGCCACCATGGCTACAAGGG-TGCTGAGC-3， Reverse5-CCCGCGGCGGCQI-GGTGGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGCCTCTTCA-TATG-3'。以人KLF5的CDNA為模板，PCR擴增C末端帶有6xHis標簽的KLF5基因命名為ALF5-6xHis。PCR條件如下：94℃變性3min，94°C 30s，55℃30s，72℃1min，30個循環(huán)，72℃；延伸10min，4℃保存。PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒回收PCR產物，然后分別用XhoI和I酶切PCR產物和P0Z-C載體，用膠回收試劑盒回收酶切后的AXF5片段與載體，用T4DNA連接酶將KLF5-6xHis與pOZ載體連接，轉化感受態(tài)DH5a，挑選陽性克隆于3mL的LB培養(yǎng)基小量擴增，并用質粒提取試劑盒提取所構建的質粒。經(jīng)XhoI和NotⅠ酶切確定目的片段的插入，測序證實插入載體目的片段的正確性，質粒被命名為P0Z-KLF5。1.3穩(wěn)定表達pOZ-KLF5質粒的細胞系篩選采用Roc.he公司的X-tremeGENE9試劑將逆轉錄病毒載體P0Z-KLF5連同病毒包裝輔助質粒gag-Pol、VSV-g—起轉染包裝細胞，48h后收集具有感染能力的逆轉錄病毒感染293T細胞，由于P0Z-KLF5質?？梢酝瑫r轉錄并表達兩種蛋白質：目的蛋白KLF5和篩選標記白細胞介素-2受體a（IL-2Ra），因此可以通過偶聯(lián)IL-2Ra抗體的DynabeadsM450磁珠篩選pOZ-KI，F(xiàn)5病毒感染的293T細胞，從而得到穩(wěn)定表達三標簽融合的目的蛋白KLF5（簡稱KLF5-3xTag）的293T細胞系。1.4pOZ-KLF5質粒在真核細胞表達的鑒定收集1.3中獲得的穩(wěn)定表達KLF5-3xTag的293T細胞的總蛋白，WestemBlot方法檢測目的蛋白KLF5-3xTag的表達情況。1.5細胞水平檢測KLF5的生物學功能使用1.3中獲得的穩(wěn)定表達KLF5-3xTag的293T細胞進行克隆形成實驗和細胞周期分析實驗，檢測KLF5-3xTag蛋白的表達對細胞增殖及細胞周期的影響。克隆形成實驗分別將100個1.3篩選的對照組和KLF5-3xTag表達組293T細胞接種到六孔板中培養(yǎng)10d，吸去上清液，用PBS洗兩遍，冰甲醇固定細胞后結晶紫染色，晾干后拍照，并對直徑超過100μm的克隆進行統(tǒng)計分析。使用同樣的對照組與KLF5-3xTag表達組293T細胞檢測細胞周期：分別離心收集lxlO6個細胞，用PBS洗兩遍后，加入預冷70%乙醇于-20°C固定過夜，第二天用PBS洗兩遍，加入PI染料和RNaseA于37℃避光孵育30min，最后用流式細胞儀檢測周期。1.6Western-blot檢測WWP1對KLF5-3xTag蛋白的降解在1.3中獲得的穩(wěn)定表達KLF5-3xTag的293T細胞內共轉染W(wǎng)WP1質粒（美國Emory大學DrnigJT教授惠贈）或者對照載體，收集細胞前4h加入20μmol/LMG132處理，收集細胞總蛋白Westem-blot檢測細胞中KLF5蛋白的含量變化，β-actin作為內參。1.7pOZ-KLF5質粒所帶標簽的免疫反應性將1.3中獲得的穩(wěn)定表達KLF5-3xTag的293T細胞與對照組細胞收集蛋白后分別選用抗FLAG-M2親和凝膠、抗HA親和凝膠、Ni-NTA瓊脂糖進行免疫沉淀（IP）實驗，然后通過Westernblot實驗來驗證KLF5-3xTag蛋白所帶標簽的免疫反應性。2結果2.1pOZ-KLF5表達載體的構建與鑒定根據(jù)pOZ載體的多克隆位點，選擇XhoI和NotI兩個限制性內切酶位點分別加入KLF5上游和下游PCR引物中；考慮到相互作用蛋白研究需要純化出大量且高純度的蛋白，我們在C端PCR引物中引入了6xHis標簽，為以后的多步驟純化提供多種選擇。以人的KLF5cDNA為模板，PCR擴增KLF5基因編碼區(qū)，獲得1392bp（l374bp的編碼區(qū)+18bp的6xHis標簽）目的片段KLF5-6xHiso將經(jīng)過XhoI和NotI限制性核酸內切酶酶切的KLF5-6xhis與pOZ載體加入T4-DNA連接酶經(jīng)過16T連接過夜，轉化DH5a感受態(tài)涂板，然后隨機挑取4個克隆于3mL的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜，抽取質粒后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定全部為陽性。將陽性克隆搖菌抽提后所得的質粒命名為P0Z-KLF5（詳見材料方法1.2）。POZ-KLF5質粒用XhoI和NotI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳再次確定目的片段的插入。pOZ-KLF5質粒雙酶切后在1392bp處出現(xiàn)目的條帶，與KLF5-6xHis基因大小一致（如圖1箭頭所示）。P0Z-KLF5質粒經(jīng)DNA測序后與基因庫中的序列完全一致，且6xHis標簽序列也準確地插入目的片段KLF5的C末端。2.2穩(wěn)定表達KLF5-3xTag細胞系篩選和檢測將陰性對照pOZ與P0Z-KLF5分別1f病毒包裝輔助質粒一起轉染包裝細胞，然后收集pOZ、P0Z-KLF5逆轉錄病毒并分別感染293T細胞。病毒感染48h后經(jīng)偶聯(lián)IL-2Rα抗體的DynabeadsM450磁珠篩選出穩(wěn)定表達KLF5-3XTag蛋白的陽性細胞（見材料與方法1.3），感染pOZ逆轉錄病毒的293T細胞作為對照組細胞。收取細胞總蛋白Western-blot分析KLF5-3xTag蛋白表達情況，抗KLF5的抗體可以檢測到KLF5-3xTag蛋白的高效表達（KLF5-3xTag條帶；Endo.KLF5為內源性KLF5蛋白），如圖2所示。2.3KLF5-3xTag生物學功能及蛋白降解檢測為驗證所構質粒表達產物KLF5-3xTag的功 能Q已知的KLF5生物功能一致，我們將2.2得到的穩(wěn)定表達KLF5-3xTag的293T細胞進行克隆形成實驗以及細胞周期分析（見材料與方法1.5）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，盡管總的細胞克隆數(shù)并沒有太大變化，KLF5-3xTag表達的293T細胞與對照組比較其形成的細胞克隆更大。對直徑達到100μm的細胞克隆數(shù)目進行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)KLF5-3xTag表達組比對照組形成100以上大克隆的數(shù)目明顯增多（p=0.0131）（圖3）。流式細胞儀對其細胞周期的分析結果顯示：KLF5-3xTag表達組處于G0/G1期的細胞比例均值為61.43%，與對照組的62.025%并無太大差別，但KLF5-3xTag的表達使處于S期的細胞比例達到18.82%，比對照組（14.28%）增加約35%；同時，KLF5-3xTag表達組處于G2/M期的細胞比例為20.26%，比對照組（24.1%）下降了約17%（圖4），并且實驗結果可重復。以上結果表明KLF5-3xTag的表達促進了細胞的增殖：使處于S期的293T細胞比例增多，促使單個細胞形成的克隆體積更大，與以前的報道一致[7、8]。已有文獻報道，KLF5屬于半衰期較短的不穩(wěn)定蛋白，可以被多種E3泛素連接酶修飾而經(jīng)蛋白酶體途徑降解，并且N端加入標簽可以影響KLK5蛋白的降解[9、10]，因此我們將融合標簽加入到KLF5蛋白的C端，為了驗證C端標簽的插入并不影響KlT5-3xTag蛋白的降解，我們在穩(wěn)定表達KLF5-3xTag的293T細胞中轉染KLF5已知的E3泛素連接酶WWP1（見材料與方法1.6），結果如圖5所示，KLF5-3xTag與內源KLF5—樣能夠被WWP1所降解，而加入蛋白酶體抑制劑MG132可以穩(wěn)定KLF5-3xTag蛋白。由此驗證了C端標簽的加入并未對KLF5蛋白降解產生影響。2.4pOZ-KLF5質粒所帶標簽的免疫反應性驗證裂解2.2得到的穩(wěn)定表達KLF5-3xTag的293T細胞，收取總蛋白后分別用抗HA親和凝膠、Ni-NTA瓊脂糖、抗FLAG-M2親和凝膠進行免疫沉淀實驗，Western-blot分析KLF5_3xTag所帶標簽是否可以有效沉淀KLF5_3xTag。Ni-NTA瓊脂糖、抗HA親和凝膠、抗FLAG-M2親和凝膠均可以通過與KLF5融合的6xHis、HA（圖6A）、FLAG（圖6B）標簽有效結合而免疫沉淀KLF5蛋白。同時為了檢測標簽免疫沉淀的效果，在穩(wěn)定表達KLF5-3xTag的293T細胞中共轉染了KLF5已知的相互作用蛋白WWP1，經(jīng)MG132處理后用抗FLAG-M2親和凝膠沉淀下KLF5蛋白的同時也可以在免疫沉淀復合物中檢測到WWP1蛋白（圖6B）。由此可見，KLF5所帶標簽均具有良好的免疫反應性且未互相影響，并且標簽可以有效免疫沉淀KLF5的相互作用蛋白。因此KLF5-3xTag可以作為尋找KLF5在特定生理、病理條件下的相互作用蛋內從而深入探索KLF5功能的有力工具。3討論KLF5作為轉錄因子通過調控許多下游基因的表達在胚胎發(fā)育、炎癥反應、心血管發(fā)生、腫瘤生長等過程中發(fā)揮重要生物學功能。已有研究表明，在不同細胞環(huán)境下，KLF5可以發(fā)揮截然不同的作用[11]；在上皮細胞的分化過程，表皮基底細胞和培養(yǎng)的非腫瘤上皮細胞中，KLF5刺激細胞增殖在多種腫瘤細胞系和TGFβ信號通路活化的非腫瘤上皮細胞中抑制細胞增殖[12-15]。與其在細胞增殖方面的雙重功能一致的是，KLF5在腫瘤形成過程中可以發(fā)揮癌基因[19]和腫瘤抑制雙重功能：很多報道顯示KLF5在多種癌癥中表達上升并與乳腺癌病人的低生存率有關[20、21]，表明KLF5發(fā)揮癌基因的作用；另有研究表明在乳腺癌和前列腺癌中KLF5基因失活[22-24]。在胃癌中KLF5表達是良性特征并與病人的高生存率有關表明KLF5是潛在的腫瘤抑制因子。KLF5存在多種翻譯后修飾，翻譯后修飾可以調控KLF5蛋內的穩(wěn)定性或改變其相互作用的蛋白從而影響甚至逆轉KLF5的功能：比如FBW7、WWP1、EFP、SMAD等可以通過影響KLF5的泛素化而影響其蛋白的穩(wěn)定性1%271；PKC、MEK/ERK、P38、GSK3β[28、29]等信號通路通過影響KLF5的磷酸化而改變KLF5的轉錄活性或者蛋白穩(wěn)定性[30、31]；p300、SET、HDAC等通過改變KLF5的乙?；绊慘LF5的生物功能[32、33]。由于轉錄因子在染色體DNA上可以通過與服務于不同轉錄機制的多種蛋白形成轉錄因子復合物調控相關基因表達，在不同環(huán)境刺激因子作用下，KLF5發(fā)生不同的翻譯后修飾改變了其蛋白構象從而改變其轉錄因子復合物的組成，使KLF5可以對同樣的一組靶基因產生完全不同的調控作用或者調控功能相反的靶基因轉錄。因此研究這些可以與KLF5相互作用的蛋白具有非常重要的意義。

為了研究KLF5的相互作用蛋白從而深入探索KLF5的生物學功能，構建了真核表達的逆轉錄病毒質粒pOZ-KLF5。通過此質粒的構建，能夠為將來研究與KLF5相互作用的蛋白、從而為進一步研究KLF5的翻譯后修飾及其對KLF5生物學功能的影響提供了新的工具。pOZ載體是逆轉錄病毒載體，可以通過感染獲得目的蛋白的高效表達。pOZ載體自身帶有FLAG和HA標簽，根據(jù)標簽與目的基因融合的位置不同，分為pOZ-N（標簽在目的蛋白N末端）與pOZ-C（標簽在目的蛋白C末端）兩種。已有報道顯示，N端的氨基酸序列對KLF5功能非常重要，并且N端融合標簽的加入可能影響KLF5的穩(wěn)定性[34、35]。因此選擇了pOZ-C載體構建P0Z-KLF5質粒。由于相互作用蛋白的分析通常聯(lián)合蛋白質譜的鑒定，因此需要純化出大量的目的蛋白化合物，為了降低實驗成本，在KLF5編碼區(qū)C端加入了6xHis標簽，這樣可以通過成本較經(jīng)濟的Ni-NTA瓊脂糖進行后續(xù)實驗。同時，相互作用蛋白的分析通常需要進行多步驟親和層析從而減少非特異性的相互作用蛋白并降低假陽性的產生，pOZ-KLF5質粒通過3種標簽蛋白（6xHis，F(xiàn)LAG，HA）的表達，為以后鑒定KLF5相互作用蛋白提供了多種標簽的選擇，并且這些標簽全部位于C未端，避免了對KLF5本身可能造成的結構、功能上的影響pOZ-KLF5質粒可以同時表達冃的蛋白KLF5-3xTag和篩選標記IL-2Ra，通過偶聯(lián)lL-2Ra抗體的DynabeadsM450磁珠進行篩選得到穩(wěn)定表達Kl.F5-3xTiig蛋白的陽性細胞。這種篩選方法避免了抗生素篩選對細胞的損傷并提高廣篩選的效率，然后通過Western-hlot實驗證明KLF5-3xTag的表達，如圖2所示，此外，可以通過3個融合標簽經(jīng)多步驟的親和層析分離純化出與KLF5特異性相互作用的蛋白，從而為深入研究KLF5的生物學功能打下基礎。將獲得的P0Z-KLF5表達陽性細胞進行流式細胞分析和克隆形成實驗，對KLF5-3xTag表達的293T的細胞周期和細胞增殖情況進行了檢測；結果顯示，KLF5-3xTag表達的293T細胞使處于細胞周期S期的細胞比例明顯增加（14.28%vs.18.82%），而S期增多是細胞處于旺盛分裂期的標志。此外，克隆形成實驗結果顯示，雖然形成的克降數(shù)目無明顯改變，但是KLF5-3xTag表達的細胞形成的克降直徑更大，說明KLF5-3xTag表達使單個細胞的增殖能力增強。通過CCK8分析檢測細胞生長曲線，并沒有觀察到KLF5-3xTag表達對生長產生明顯影響，可能是由于293T是永生化的作惡性轉化的細胞，與報道的惡性增殖的腫瘤細胞存在細胞背景及信號通路等差異[36-38]，但KLF5確實對293T細胞的增殖有一定的促進作用KLF5屬于半衰期較短的不穩(wěn)定蛋白，在體內主要被多種E3泛素連接酶泛素化并通過蛋白酶體途徑降解，WWP1是最先被報道的可以降解KLF5蛋白的E3泛素連接酶[39]。報道顯示，WWP1能通過與KLF5的PY結構相互作用從而泛素化并降解KLF5蛋白[40]，之前報道在KLF5蛋白N端插入標簽會影響WWP1對KLF5的降解，所以我們構建的P0Z-KLF5質粒所帶標簽都位于KLF5蛋白的C端，并且通過實驗證明標簽不影響WWP1對KLF5蛋白的降解（圖5）。為了驗證KLF5所帶標簽的免疫反應性，用KLF5-3xTag蛋白所帶3種不同的標簽分別進行免疫沉淀實驗，驗證了KLF5所帶的標簽均可以成功免疫沉淀KLF5蛋白，并且在免疫沉淀的復合物中我們還成功檢測到了已知與KLF5相互作用的蛋白WWP1（圖6），證明了P0Z-KLF5質粒所帶標簽均具有很好的免疫反應性，可以作為研究KLF5相互作用蛋白進而深入研究KLF5功能的有力工具。通過一系列的實驗，證明了pOZ-KLF5質粒C末端所帶的3個標簽能夠分別發(fā)揮效應，成功地免疫沉淀KLF5蛋內，并可以檢測到已知的KLF5相互作用蛋白。生物學功能的檢測也發(fā)現(xiàn)KLF5-3xTag的功能與之前報道一致，且C末端所帶標簽對KLF5的降解并無影響：因此，該質粒的構建能夠更加方便在特定的病理生理條件下分析KLF5的相互作用蛋白，為深入研究KLF5的生物功能奠定基礎。參考文獻（References）：[1]DONG J T， CHEN C. 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