歐海龍 張禮林 何曉蘭 李紅梅 雷霆雯

摘要：ApoE-/-基因敲除小鼠（ApoE-/-）經(jīng)含有21%脂肪和0.15%膽固醇的高脂飼料喂食12周后進行各項血脂膽固醇水平檢測，以及整體主動脈油紅0染色與主動脈根部病理切片油紅0染色等動脈粥樣硬化病理分析。結果顯示經(jīng)過高脂誘導的ApoE-/-小鼠的血漿總膽固醇和甘油三酯水平均比未經(jīng)飲食誘導的ApoE-/-小鼠、經(jīng)同樣飲食處理的野生型小鼠以及未經(jīng)處理的野生型小鼠均顯著升高（P<0.05）；低密度脂蛋白-膽固醇水平與野生型（正常飲食組和高脂組）相比升高了近3倍多；高脂誘導ApoE-/-小鼠的主動脈斑塊面積占整體主動脈面積的65%，顯著高于ApoE-/-小鼠的正常飲食組（21%）（P<0.05），同時主動脈根部的血管壁明顯增厚，管腔變窄。實驗結果表明通過高脂飼料飲食誘導，成功建立了動脈粥樣硬化模型小鼠，可為下游的藥物篩選、基因治療以及動脈粥樣硬化機理的體內(nèi)研究提供理想的實驗材料。關鍵詞：ApoE-/- 小鼠；動脈粥樣硬化；膽固醇；血脂；主動脈中圖分類號：R394 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）02-0141-04The Establishment of Atherosclerosis Model in ApoE-/- MiceOU Hai-long， ZHANG Li-lin，HE Xiao-lan， LI Hong-mei， LEI Ting-wen（Department of Biochemistry and Molecular Biology， Guiyang Medical University， Guiyang 550004， Guizhou， China）Abstract ： The ApoE gene knockout mice （ApoE-/-） were fed with a high-fat （HF） diet containing 21% fat and 0.15% cholesterol for 12 weeks to establish atherosclerosis model. After diet induction， the ApoE-/- mice were sacrificed and plasma total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， low -density lipoprotein -cholesterol （LDI-C） and high-density lipoprotein-cholesterol （HDL-C） levels were measured. The whole aortas and sequential sections of the aortic root were stained with oil red 0. Results showed that the plasma levels of TC and TG from HF diet induced ApoE-/- mice were both dramatically higher than normal diet（ND）-fed ApoE-/- mice as well as wild-type mice fed with normal diet or HF diet （P <0.05）. The contents of LDL-cholesterol in plasma were elevated by three-fold compared with wild-type （ND and HFD）. Atherosclerotic lesion sizes were significantly increased in whole aorta （65%） as compared with normal diet ApoE-/-mice （21%）. Similar result was obtained from cross -sections of the aortic root analysis. The results demonstrated that HF diet treatment greatly enhanced atherosclerosis development in ApoE-/-mice. The establishment of atherosclerosis model mice provides a valuable tool for drug screen， gene therapy and even in vivo mechanism analysis in atherosclerosis disease.Key words ： ApoE-/-mice； atherosclerosis； cholesterol； lipoprotein； aorta（Life Science Research， 2015， 19（2）：141 ?144）體內(nèi)的脂類物質代謝異常時，多余的脂質沉積在血管壁上，并逐漸形成斑塊，使血管內(nèi)皮增厚、變硬，是引起動脈粥樣硬化（atherosclerosis AS）的重要原因之一。載脂蛋白E（apo；ipoprotein E，apoE） 主要存在于乳糜微粒（chylomicrom，CM）、極低密度脂蛋白（verylowdesitylipoprotein，LDL）等多種血漿脂蛋白中，可介導脂蛋白殘粒的攝取，維持血漿膽固醇的平衡、促進泡沫細胞中膽固醇的外流以及具有抗氧化和消炎等作用，該基因缺陷將使體內(nèi)脂代謝發(fā)生紊亂。ApoE基因敲除的純合小鼠（ApoE-/-）可正常存活和繁殖，當給予適當?shù)母咧嬍硶r，可導致各種高脂蛋白血癥[1.2]，是動脈硬化研究的常用工具。本研究以C57BL/6純系的ApoE-/-小鼠為材料，通過高脂飼料喂養(yǎng)，成功誘導其形成動脈粥樣硬化病變小鼠模型，該模型可為下游的藥物篩選、基因治療以及動脈粥樣硬化機理的體內(nèi)研究提供理想的試驗材料。1材料與方法1.1試劑和儀器體視顯微鏡（江南永新，南京），倒置顯微鏡（TS100F，Nikon公司，日本），冰凍切片機（CM1850，Leica公司，德國）；小鼠基礎飼料由貴陽醫(yī)學院動物中心提供；尹紅、蘇木素購自北京賽弛生物公司；油紅0購自北京鼎國生物公司；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測試劑盒購自南京建成生物公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2試驗動物C57BL/6純系背景的載脂蛋白E基因敲除小鼠（ApoE-/-）購自南京大學模式動物研究所，引種協(xié)議[2012]470號。動物飼養(yǎng)環(huán)境條件為室溫20-25℃，相對濕度40%～70%。對6周齡左右的雄性（ApoE-/-小鼠（n=8）進行高脂肪飼料喂養(yǎng)（21%脂肪和0.15%膽固醇），喂食12周之后，對體重為25?30g的小鼠進行解剖并抽取靜脈血用于下一步實驗。1.3血脂水平的檢測方法血清總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三月脂（Triglyceride，TG）水平的測定分別采用膽固醇氧化酶法（C0D-PAP）及磷酸甘油氧化酶法（GP0-PAP），最后通過分光光度計在500nm測得吸收值。低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定方法均按照南京建成試劑盒說明書進行操作。1.4主動脈整體染色方法小鼠采血后，在麻醉下用PBS進行灌注，分離獲得整體主動脈，清除其余脂肪和結締組織后，用PBS清洗干凈，于4%多聚甲醛中固定12h以上，再縱向剖開。主動脈經(jīng)70%乙醇中浸泡2min后進行油紅0染色30min（用異丙醇配成0.5%的母液，再以3：2的比例稀釋成工作液）；70%乙醇漂洗至組織發(fā)白，經(jīng)蒸餾水清洗數(shù)次后拍照，并用Image-Pro Plus 6.0.（IPP6.0）軟件（Media Cybernetics）對斑塊面積進行定量分析。1.5主動脈根部斑塊組織化學分析方法取出心臟固定48h后，從心耳下方切取主動脈根部，再進行蔗糖脫水，0CT（Optimal cutting temperature compound）包埋?？焖倮鋬鲋髲闹鲃用}瓣開始以100μm為間距切取連續(xù)5張厚度為8μm的切片。切片進行油紅0染色。染色方法同1.4。1.6統(tǒng)計方法實驗結果的數(shù)據(jù)均表達為均數(shù)±標準差。各組數(shù)據(jù)之間顯著性檢驗用多個樣本均數(shù)比較及兩兩比較的t檢驗分析。2結果2.1 血脂檢測ApoE-/-小鼠在高脂飼料飲食誘導12周后，取靜脈血進行TC、TG、LDL-C和HDL-C水平檢測。結果顯示經(jīng)高脂誘導小鼠的TC和TG含量比未經(jīng)誘導的野生型和ApoE-/--小鼠，以及經(jīng)高脂誘導的野生型小鼠均顯著升高（P<0.05）（表1），其中比未經(jīng)誘導ApoE-/-小鼠的TC含量提高了50%。高脂組ApoE-/-小鼠的LDL-C水平比其他三組對照小鼠也存在不同程度的提高，特別是與野生型（正常飲食組和高脂組）相比升高了近3倍多；HDL在體內(nèi)具有抗動脈粥樣硬化作用，其水平與正常飲食的ApoE-/-小鼠相比有顯著升高，但與野生型（正常飲食組和高脂組）相比變化相對較?。ū?）。2.2動脈粥樣硬化的病理分析對實驗小鼠進行解剖，獲取主動脈，通過油紅0染色的方法確定脂質在整體主動脈壁上的積累程度，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)高脂飼料飲食誘導后ApoE-/-小鼠的主動脈弓、腹主動脈、胸主動脈以及髂總動脈分支處均可見明顯的粥樣硬化斑塊，斑塊內(nèi)的脂質被油紅0染成紅色，其陽性比例高達65%，比未經(jīng)誘導處理的同窩出生的小鼠（21%）顯著升高（P<0.05）（圖1）。同時，獲取主動脈根部，經(jīng)冷凍切片后進行油紅0染色。我們發(fā)現(xiàn)結果與整體主動脈染色的相似，在經(jīng)高脂飼料飲食誘導后小鼠中，其主動脈根部的血管壁明顯增厚，紅色脂質沉積在管壁面上，使管腔狹窄，而未經(jīng)處理的ApoE-/--小鼠的斑塊面積占動脈總面積的比例相對較?。▓D2）。3討論小鼠對膽固醇表現(xiàn)出比人類更強的耐受力，發(fā)生動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）的進程和病變好發(fā)部位與人類也均有一定的差異，所以曾一度被認為不適合作為動脈粥樣硬化研究的模式動物[3.4]。后來人們發(fā)現(xiàn)C57BL/6背景的小鼠品系對膽間醇相對較為敏感，特別是Piedrahita等在1992年成功制備出的C57BL/6背景的ApoE基因敲除小鼠，當其給予高脂飲食，較易誘發(fā)AS而且病變進程與人類的相似，可發(fā)展至平滑肌細胞浸潤等中晚期粥樣病變[5.6]。再加上小鼠本身易于繁殖，飼養(yǎng)成本較低等優(yōu)點，使ApoE-/-小鼠取代之前常用的兔、大鼠、豬等動物，成為近年來進行AS研究的主要模式動物。在20世紀60年代，人們采用30%脂肪、5%膽固醇和2%的膽汁酸成功誘導出C57BL/6的AS小鼠，但是該飼料對小鼠不是很健康，易使小鼠體重減輕、并發(fā)呼吸系統(tǒng)感染等炎癥反應。1985年Paigen等對上述飼料進行了改進，發(fā)明了“Paigen飼料”包括15%脂肪、1.25%膽固醇和0.5%的膽汁酸，降低了原飼料的毒性，并取得不錯的誘導效果[7]。之后人們在上述飼料的基礎上對其成分和比例進行再次調整，制備出了更為健康的飼料（21%脂肪和0.15%膽固醇），由于與美國人的飲食習慣較為接近，被稱為“西方型”詞料。本研究中我們采用該飼料對ApoE-/-小鼠進行誘導，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過3個月的誘導后，高脂誘導小鼠的TC含量比未經(jīng)誘導ApoE-/-小鼠上升了50%；LDL-C水平與野生型相（正常飲食組和高脂組）相比升高了近3倍多。主動脈斑塊面積占整體主動脈的面積比提高了近60%，AS病變效果顯著。該小鼠可為AS的多方面研究提供實驗動物模型：藥物篩選；分子干預，如基因治療等；以及AS相關的病理機制研究，比如分析在AS病變下的生理特征、相關基因表達譜的改變等。主動脈整體染色可以非常直觀地反應出AS的病變程度，是AS研究中常用的一種分析手段，但在具體操作細節(jié)上根據(jù)不同的實驗材料稍有差異。有的研究者在獲取小鼠整體主動脈之后不進行甲醛固定或縱向切開后再進行固定[8]。本實驗則采用立即固定的方法，主要是由于小鼠動脈管比較嫩，固定后就會變得堅韌，這有利于血管外周粘附著豐富的脂肪以及血管的剖開等操作。染色之后，在觀察主動脈并拍照時，人們通常利用細針將經(jīng)縱向切開后的血管固定在蠟板上，使其展現(xiàn)出內(nèi)膜，這在大動物上較易操作。小鼠主動脈較細，通過細針展現(xiàn)內(nèi)膜的方法不好操作；本研究將剖開后的血管貼在透明膠布上，實驗證明該方法可以很方便地將血管平面展開，內(nèi)膜暴露，而不必借助于細針。主動脈根部是小鼠AS病變的好發(fā)部位，對該位置的病理分析已成為小鼠AS程度評價的一個主要指標。在對主動脈根部進行切片制作時，我們認為取材最為關鍵。解剖獲得心臟之后，在緊貼心臟處，垂直于動脈瓣的方向切斷升主動脈，保證使3個動脈瓣處于同一平面上。接著包埋、切片，由于考慮到后期要進行油紅0染色，因此本實驗采取冷凍切片。切下的片子先不染色，在體視顯微鏡下觀察切面情況，當出現(xiàn)主動脈瓣結構時，正式貼片、染色[9.10]?？傊狙芯坑煤?1%脂肪和0.15%膽固醇的高脂飼料誘導ApoE-/-小鼠，經(jīng)12周的飲食處理后，血漿總膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白指標明顯升高，而且主動脈斑塊顯著增多，主動脈根部管壁增厚，表現(xiàn)出典型的動脈粥樣硬化病理特征。該小鼠可用于下一步的藥物干預和病理機制的研究。參考文獻（References）：[l]PLUMP A S， SMITH J D， HAYEK T， et al. Severe hyperc-holesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells [J].Cell，1992，71（2）：343-353.[2]NAKASHIMA Y， PLUMP A S， RAINES E W， et al. ApoE- deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree[J]. Arteriosclerosis， Thrombosis， and Vascular Biology，1994，14（1）：133-140.[3]FAZIO S， LINTON M F. Mouse models of hyperlipidemia and atherosclerosis[J]. Frontiers in Bioscience，2001，（6）： 515-525.[4] JAWIEN J， NASTALEK P， KORBUT R. Mouse models of ex-perimental atherosclerosis[J]. Journal of Physiology and Pharmacology，2004，55（3）：503-517.[5]PIEDRAHITA J A， ZHANG S H， HAGAMAN J K， et al Gen?eration of mice carrying a mutant apolipoprotein E gene inac?tivated by gene targeting in embryonic stem cellsfj）. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America， 1992，89（10）：4471-4475.[6]ZHANG S H， REDDICK R L， PIEDRAHITA J A， et al. Spon-taneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E[J].Science，1992，258（5081）： 468-471.[7]PAIGEN B， MORROW A， BRANDON C， et al. Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of micef[J].Atherosclerosis，1985， 57（l）：65-73.[8]肖銘甲，陳衛(wèi)紅，郭景新，等.芥菜籽提取物抗氧化及下調巨噬細胞清道夫受體CD36表達和預防動脈粥樣硬化的作用 [J].中國動脈硬化雜志（XIAO Min-jia， CHEN Wei-hong， GUO Jing-xin， et al. Sinapis alba extract regulates CD36 expression and prevents atherosclerosis as an antioxidant[J]， Chinese Journal of Arteriosclerosis），2013，21（2）：109-114.[9]張亮，官泉生，彭婉芬，等.冷凍切片結合油紅0染色在動脈粥樣硬化小鼠模型中的應用[J].臨床與實驗病理學雜志 （ZHANG Liang， GUANG Quan-sheng， PENG Wan -fen， et al. The application of frozen section and oil red 0 staining in atherosclerotic model mice[J]. Chinese Journal of Clinical Experi-mental Pathology），2011，27（2）：210-211.[10]潘琳.實驗病理學技術圖鑒[Ml.北京：科學出版社（PAN Lin. Alas of Experimental Pathology Techniques[M]. Beijing： Science Press），2012.76-82.