余樹培　夏文龍　胡成等

摘要[目的] 用大腸桿菌表達(dá)出CIAV的衣殼蛋白（VP1）作為免疫抗原，以建立雞傳染性貧血病毒（CIAV）的血清學(xué)診斷方法。[方法] 根據(jù)已發(fā)表的CIAV的衣殼蛋白（VP1）序列，結(jié)合Protean軟件預(yù)測出抗原富集區(qū)域，設(shè)計并合成1對引物，利用PCR擴(kuò)增該區(qū)域基因，將擴(kuò)增成功的VP1基因片段經(jīng)T4連接酶連接至PGEX6P1表達(dá)載體。連接成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同的大腸桿菌表達(dá)菌株，通過IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行原核表達(dá)，篩選出表達(dá)量最高的菌株及最佳誘導(dǎo)時間和IPTG誘導(dǎo)濃度。以感染CIAV的雞陽性血清為一抗，對重組蛋白GSTVP1進(jìn)行Westernblot分析。[結(jié)果] 成功獲得了重組質(zhì)粒PGEXVP1，誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDSPAGE和Westernblot分析，分子量約71 kD的融合蛋白GSTVP1在大腸桿菌Rosseta中以包涵體形式大量表達(dá)，并能與雞傳染性貧血病毒陽性血清發(fā)生反應(yīng)。[結(jié)論] 該研究可為抗CIAV單克隆抗體的制備及血清學(xué)診斷方法的建立等研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞雞傳染性貧血病毒；VP1蛋白；原核表達(dá)

中圖分類號S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2015）28-118-04

Prokaryotic Expression and Identification of Capsid Protein of Chicken Infectious Anemia Virus

YU Shupei1，2， XIA Wenlong1，2， HU CHeng1，2， CHENG Darong1，2* et al （1.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225009；2.Jiangsu Coinnovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou， Jiangsu 225009）

Abstract [Objective] The research aimed to use capsid protein （VP1） of chicken infectious anemia virus （CIAV） expressed by Escherichia coli as immunizing antigen and establish the serological diagnosis method of CIAV. [Method] According to the published VP1 sequence of CIAV， the antigenenriched regions were predicted by using Protean software. A pair of primers were designed and synthesized for the amplification of targeted VP1 genes by PCR. The amplified fragment of VP1 genes was connected to PGEX6P1 expression vector by T4 DNA ligase. The recombinant plasmid after correct connection was used to transform different strains of Escherichia coli for prokaryotic expression by IPTG inducement. The strain with the highest expression amount was screened out， and the best inducement time and the best inducement concentration of IPTG were confirmed. The positive serum o chicken infected with CIAV was used as primary antibody to conduct Westernblotting on recombinant protein GSTVP1. [Result] The recombinant plasmid PGEXVP1 was successfully obtained and verified by SDSPAGE and Western blot. The fusion protein GSTVP1 with the molecular weight of about 71 kD was abundantly expressed in Rosseta of E. coli in the form of inclusion body. And the recombinant protein could react with positive serum of chicken infectious anemia virus. [Conclusion]The research could lay the foundation for preparing antiCIAV monoclonal antibody and establishing the serological diagnosis method of CIAV.

Key words Chicken infectious anemia virus； VP1 protein； Prokaryotic expression

雞貧血病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV）是雞傳染性貧血?。–hicken infectious anemia，CIA）的病原，該病毒能夠造成雞的造血器官和淋巴組織受損，出現(xiàn)再生障礙性貧血、全身淋巴組織萎縮和免疫抑制，是雞的主要免疫抑制性疾病病原之一。1979年由日本學(xué)者Yuasa等[1]首次報道該病毒，我國于1992年由崔現(xiàn)蘭[2]等首次分離到，在印度、韓國等國家也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該病[3]。由于該病毒宿主范圍窄，只感染雞和火雞[4]，并且對成年雞一般不引起明顯的臨床癥狀，因此并未引起廣大養(yǎng)殖戶和臨床獸醫(yī)的重視。但是，CIAV感染雛雞后往往引發(fā)嚴(yán)重的免疫抑制，導(dǎo)致各種繼發(fā)性感染和生產(chǎn)能力下降，因此有必要建立特異性的分子生物學(xué)檢測方法，在雞群早期進(jìn)行CIAV的監(jiān)測。

CIAV基因組為單股環(huán)狀DNA，全長2.3 kb左右，共含有3個開放讀碼框，分別編碼 VP1、VP2和 VP3蛋白。VP1蛋白是CIAV 的衣殼蛋白，在刺激機體產(chǎn)生抗體方面起著重要作用，是主要的免疫原蛋白[5]；VP2 作為輔助蛋白，能幫助 VP1 形成正確的構(gòu)象。Koch等[6]研究發(fā)現(xiàn)VP1只有與VP2共同表達(dá)時，才可以刺激機體產(chǎn)生中和抗體，二者相互協(xié)調(diào)才能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，VP3蛋白主要作用是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其中，VP1蛋白是刺激機體產(chǎn)生抗體的主要靶位點，因此選擇制備VP1的重組蛋白來作為免疫抗原。VP1蛋白由449個氨基酸構(gòu)成，大小約為51.6 kD，因為分子量不大。國外學(xué)者Pallister[7]將完整的VP1以谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白的形式在大腸桿菌進(jìn)行了表達(dá)，然而經(jīng)SDSPAGE電泳分析表達(dá)量極低，無法滿足高低度抗體的制備。因此，筆者利用Protean軟件對VP1全長進(jìn)行分析，選擇抗原表位較為豐富的區(qū)域進(jìn)行表達(dá)。

筆者以實驗室分離到的CIAV基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出VP1基因中抗原表位較集中的片段，長度為1 164 kb，克隆至pMD18T載體并測序正確后，酶切回收小片段并經(jīng)T4連接酶連至PGEX6P1表達(dá)載體中，連接成功的PGEXVP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同的大腸桿菌表達(dá)菌株，利用IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行原核表達(dá)，篩選出表達(dá)量最高的菌株以及最佳誘導(dǎo)時間和IPTG誘導(dǎo)濃度。最后，以感染CIAV的雞陽性血清為一抗，對重組蛋白GSTVP1進(jìn)行Westernblot分析，以期為CIAV單克隆抗體的制備以及血清學(xué)診斷方法的建立提供候選抗原。

1材料與方法

1.1試驗材料

CIAV毒株由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院實驗室分離保存；表達(dá)載體PGEX6P1、感受態(tài)細(xì)胞DH5α、大腸桿菌BL21、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和BL21（DE3）Rosseta菌株由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院實驗室保存；Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000、DL5000，購自寶生物工程（大連）有限公司；EcoRI、SalI限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase均為Thermo公司產(chǎn)品；預(yù)染蛋白Marker購自上海生工生物工程有限公司；HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG購自Sigma公司。其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2試驗方法

1.2.1引物的設(shè)計合成與VP1片段的擴(kuò)增。

根據(jù)GenBank中發(fā)表的CIAV標(biāo)準(zhǔn)毒株Cux1序列，針對VP1基因的抗原富集區(qū)域設(shè)計擴(kuò)增引物，引物序列見表1，并在上下游引物的5端分別引入EcoRI和SalI酶切位點（下劃線部分）。引物交由上海生工生物工程有限公司合成。

按照常規(guī)方法提取CIAV的基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物用0.1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2克隆載體pMDVP1的構(gòu)建和鑒定。

擴(kuò)增后的VP1基因片段切膠回收后，與pMD18T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。然后，挑取單菌落搖菌提質(zhì)粒，使用EcoRI、SalI雙酶切鑒定，同時將陽性克隆送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3重組質(zhì)粒PGEXVP1的構(gòu)建及酶切鑒定。

重組質(zhì)粒pMD18VP1用EcoRI和SalI雙酶切后回收小片段，表達(dá)載體PGEX6P1經(jīng)相同酶雙酶切后回收，在T4 DNA連接酶的作用下過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性重組菌落命名為PGEXVP1，并利用EcoRI和SalI對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.4重組蛋白表達(dá)菌株的篩選。

將PGEXVP1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和BL21（DE3）Rosseta菌株中，挑取單菌落后接種于5 ml含氨芐抗生素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期生長（OD600=0.7），加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，將菌液離心收集后用PBS緩沖液重懸，超聲波裂解菌體，進(jìn)行SDSPAGE電泳分析。

1.2.5重組蛋白GSTVP1表達(dá)條件的優(yōu)化及可溶性檢測。

篩選出最合適的表達(dá)菌株后，將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行超聲波裂解，收集裂解上清和沉淀，觀察目的蛋白是可溶性表達(dá)還是以包涵體形式表達(dá)；隨后取OD值為0.7的重組菌在不同誘導(dǎo)時間、不同IPTG濃度下進(jìn)行表達(dá)，摸索最佳表達(dá)條件。

1.2.6融合蛋白GSTVP1的Western blot分析。

將重組蛋白樣品經(jīng)SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC）上，在37 ℃條件下用5%（w/v）脫脂奶粉封閉1 h，然后轉(zhuǎn)入經(jīng)封閉液1∶1 000稀釋的雞抗CIAV的陽性血清中，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌后再轉(zhuǎn)入經(jīng)PBS緩沖液1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG中，37 ℃孵育1 h，最后用 ECL法進(jìn)行顯色。

2結(jié)果與分析

2.1VP1基因片段的擴(kuò)增

以制備的CIAV基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了預(yù)期大?。? 164 bp）的特異性目的條帶（圖1）。

2.5融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

為了獲得重組蛋白的最佳誘導(dǎo)條件，將誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)劑IPTG濃度設(shè)置了梯度進(jìn)行最佳條件的摸索。經(jīng)過SDSPAGE分析，當(dāng)誘導(dǎo)時間過夜（圖6）、IPTG濃度1.0 mmol/L（圖7）時，即可得到最佳表達(dá)量。

3討論

雞傳染性貧血在國內(nèi)發(fā)生較晚，CIAV由崔現(xiàn)蘭等[2]于1992年首次分離到，并且由于臨床病變不明顯、致死率較低，并未引起養(yǎng)殖戶及臨床獸醫(yī)的重視。然而，CIAV除了引發(fā)造血功能障礙，作為一種免疫抑制性病毒，同傳染性法氏囊病毒（IBDV）、白血病病毒（ALV）等一樣，能夠造成免疫功能減弱，降低雞群對多種傳染病的抵抗力，引發(fā)較大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，有必要建立分子生物學(xué)的檢測方法，在雞群早期進(jìn)行CIAV的監(jiān)測。CIAV是一種無囊膜病毒，其抗原特異性取決于顆粒表面的衣克蛋白，衣殼蛋白（VP1蛋白）作為CIAV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)以及CIAV的抗原、抗體檢測方面有著重要作用[8]，因此可以利用該蛋白作為抗原來免疫小鼠獲得針對CIAV的特異性的抗體，以此抗體為基礎(chǔ)來建立ELISA試劑盒、膠體金試紙條等分子生物學(xué)檢測工具。

作為目前較為成熟的表達(dá)系統(tǒng)，大腸桿菌的原核表達(dá)具有制備工藝方便、產(chǎn)量高、經(jīng)濟(jì)成本低等優(yōu)點，但是VP1蛋白的N端氨基酸中富含精氨酸及其他大腸桿菌的稀有密碼子，并且有多個兩兩相連靠在一起的精氨酸序列，這為該蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)造成了一定困難。針對此情況，許多學(xué)者刪除了N端的氨基酸[9]、對VP1進(jìn)行了截短表達(dá)。國外有學(xué)者通過密碼子優(yōu)化重新設(shè)計了VP1蛋白的基因，以提高蛋白表達(dá)量[10]。此外，國內(nèi)也有人使用畢赤酵母完成了真核表達(dá)[11]，這些手段相對而言較為繁瑣，并且根據(jù)這些文獻(xiàn)描述，將VP1基因截短表達(dá)后，單獨的N端或C端蛋白經(jīng)Westernblot檢驗不能與CIAV陽性雞血清發(fā)生反應(yīng)，可能對其生物活性造成了影響。筆者表達(dá)了VP1的第1～388位氨基酸多肽，最大限度地保留了VP1蛋白的全長，同時為了去除N端稀有密碼子的影響，采用大腸桿菌Rosetta作為表達(dá)菌，該菌株通過一個相容性氯霉素抗性質(zhì)粒補充了稀有密碼子的tRNAs，可以增強帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達(dá)。SDSPAGE結(jié)果亦證實GSTVP1融合蛋白在Rosetta菌株中的

表達(dá)量比在BL21、BL21（DE3）、DE3pLysS等菌株中高。

該試驗所表達(dá)的GSTVP1融合蛋白以包涵體的形式存在，這可能是由于融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時，缺乏適當(dāng)?shù)募庸づc修飾，翻譯完成后不能完全折疊成天然構(gòu)象分泌出細(xì)胞外，但是經(jīng)過Westernblot檢測可以與臨床上采集的CIAV病例的血清反應(yīng)，因此可以作為檢測抗原進(jìn)行CIAV的血清學(xué)診斷。GSTVP1蛋白在大腸桿菌中的成功表達(dá)為CIAV的單克隆抗體的制備、基于VP1重組抗原的CIAV間接ELISA診斷方法等分子生物學(xué)研究提供了基礎(chǔ)材料，為今后CIAV的診斷、監(jiān)測及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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