王存等

摘 要 采用生化測定的方法對黃花美冠蘭[Eulophia flava（Lindley） Hooker f.]花芽分化過程中假鱗莖內(nèi)可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和總核酸含量的變化進(jìn)行研究。結(jié)果表明：整個花芽分化過程中可溶性糖和可溶性蛋白含量均呈先下降后大幅上升的變化趨勢，C/N呈先大幅降低后緩慢升高，總核酸含量的變化呈先降低后升高再降低，且波動幅度較大。表明假鱗莖中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和總核酸的代謝與黃花美冠蘭花芽分化緊密相關(guān)。

關(guān)鍵詞 黃花美冠蘭；花芽分化；糖；蛋白質(zhì)；核酸

中圖分類號 S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Changes of soluble sugar， soluble protein and nucleic acid contents in pseudobulbs of E. flava were studied by biochemical measurements during the flower bud differentiation. The results demonstrated： during the flower bud differentiation， soluble sugar and soluble protein contents in pseudobulbs reduced slightly at first and then increased rapidly. Changes of C/N value of pseudobulbs showed a sharp decline initially and followed by a slow rise. Changes of nucleic acid contents in pseudobulbs showed high-low-high-low and the fluctuation was obvious. The results indicated that metabolism of soluble sugar， soluble protein and nucleic acid closely related to flower differentiation.

Key words Eulophia flava；Floral bud differentiation；Sugar；Protein；Nucleic acids

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.017

黃花美冠蘭[Eulophia flava（Lindley） Hooker f.]屬于蘭科（Orchidaceae）美冠蘭屬（Eulophia）植物。黃花美冠蘭系地生蘭，在野外常生于低海拔丘陵地疏林灌叢中，性喜高溫、干爽、光照充足的氣候環(huán)境，喜酸性土壤，耐干旱，耐瘠薄，不耐蔭蔽，忌澇，畏寒冷，生長適溫為25～30 ℃。假鱗莖生于地下，近圓柱狀，有數(shù)節(jié)，疏生數(shù)條根。葉生于假鱗莖頂端，通常2枚，紙質(zhì)，披針形，長20～40 cm，寬4～7 cm?；ㄈ~同萌，花葶側(cè)生，常從假鱗莖上部節(jié)上發(fā)出，粗壯，高可達(dá)1 m；總狀花序直立，長35～40 cm，疏生10余朵花；花型美觀，花朵大，直徑可達(dá)4 cm，檸檬黃色，開放熱烈；花期4～6月；單花期約2周，是極具開發(fā)價值的切花資源。20世紀(jì)80年代末，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院在“海南島花卉種質(zhì)資源考察”中就已將其列為重點(diǎn)推薦的野生蘭種類[1-3]。

目前，國內(nèi)對于黃花美冠蘭已開展了一些研究，內(nèi)容涉及黃花美冠蘭的原生境調(diào)查及生長發(fā)育規(guī)律[4]、主要營養(yǎng)元素含量變化[5]、施肥配方[6]、核型分析[7]、組織培養(yǎng)[8-9]、內(nèi)生真菌[10]及切花保鮮[11]等。黃花美冠蘭的花期在4～6月，時值花卉銷售淡季，市場需求量不大。如果將花期調(diào)控至春節(jié)，則能提高其銷售量及價格，從而推動黃花美冠蘭的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展?；ㄑ糠只南嚓P(guān)研究是花期調(diào)控研究的基礎(chǔ)，目前對于黃花美冠蘭的花芽分化研究僅限于花芽分化過程的組織學(xué)觀察[12]，更為深入的研究尚未見報道。碳水化合物和蛋白質(zhì)作為能量物質(zhì)和結(jié)構(gòu)物質(zhì)在花芽分化過程中起著重要的作用[13]，而花芽分化與遺傳物質(zhì)核酸有關(guān)[14]，因此筆者從花芽分化過程中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)及核酸含量的變化分析假鱗莖的代謝特征，以期為黃花美冠蘭的花期調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃花美冠蘭為當(dāng)年生假鱗莖，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所花卉試驗(yàn)基地，橫徑大于4.5 cm，大小一致，無損傷無病蟲害。

1.2 方法

1.2.1 前處理方法 時間：2009年9月17日～2010年3月28日。在2009年9月17日、11月4日、12月22日及2010年2月8日、3月28日分別取樣，每次取當(dāng)年生假鱗莖3個，剝?nèi)ト~（鞘）片，稱取鱗莖約5 g，液氮速凍后立即置于-80 ℃的冰箱中固定保存，用于可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和核酸含量的測定。

1.2.2 可溶性糖含量的測定 采用蒽酮法[15]。提取液的制備：稱取1.0 g樣品，置于研缽中，加入少量蒸餾水，研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)入20 mL刻度試管中，用10 mL蒸餾水分次洗滌研缽，洗液一并轉(zhuǎn)入刻度試管中。置沸水浴中加蓋煮沸10 min，冷卻后過濾，濾液收集于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。

可溶性糖含量的測定：準(zhǔn)確吸取提取液1 mL，置于20 mL具塞刻度試管中，加1 mL水和0.5 mL蒽酮試劑。再緩慢加入5 mL濃H2SO4，必須將試管置冰水浴中，并沿管壁緩緩加入，待全部試管加完試劑后，同時搖勻，放入沸水浴中，加熱10 min，取出后在自來水中冷卻。在620 nm波長下測定其吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得可溶性糖含量。

可溶性糖含量/（mg/g FW）=[C×VT×D/（W×VS×106）]×1 000

式中：C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得可溶性糖的含量（μg）；VT表示提取液的體積（mL）；VS表示測定時用液量（mL）；D為稀釋倍數(shù)；W表示樣品鮮重（g）。

1.2.3 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[16]。提取液的制備：稱取假鱗莖鮮樣0.5 g于研缽中，加5 mL蒸餾水，冰浴中研磨成勻漿，4 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中。再向渣中加入2 mL蒸餾水，懸浮，4 000 r/min離心10 min，合并上清液，定容至刻度。

可溶性蛋白質(zhì)含量的測定：取一支具塞試管，準(zhǔn)確加0.l mL樣品提取液，加0.9 mL蒸餾水，加5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，蓋上塞子，搖勻。放置3 min，在595 nm波長下測定其吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得可溶性蛋白質(zhì)含量。

可溶性蛋白質(zhì)含量/（mg/g FW）=[C×VT×D/（W×VS×106）]×1 000

式中：C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得可溶性蛋白質(zhì)的含量（μg）；VT表示提取液的體積（mL）；VS表示測定時用液量（mL）；D為稀釋倍數(shù)；W表示樣品鮮重（g）。

1.2.4 核酸含量的測定 取樣品0.5 g，加8 mL 80%乙醇研磨（分3次加），離心（4 000 r/min，20 min）去除上清液；取沉淀加80%乙醇8 mL混合均勻，離心（4 000 r/min，20 min）去除上清液；取沉淀加乙醇‥乙醚‥三氯甲烷（2‥2‥l，V乙醇/V乙醚/V三氯甲烷）混合液8 mL混合均勻，離心（4 000r/min，20 min）去除上清液，重復(fù)1次；取沉淀加4 mL 0.5 mol/L高氯酸90 ℃水解10 min（4 000 r/min，20 min）離心， 取上清液（約1.5 mL），再將沉淀加2 mL 0.5 mol/L高氯酸于90 ℃水解10 min（4 000 r/min，20 min）離心，取上清液1.5 mL，將2次上清液合并，共3 mL，將其混合均勻。取l mL上清液加3 mL高氯酸，混合均勻，蒸餾水為對照，用紫外可見分光光度計測定OD260和OD280。

核酸含量/（μg/g FW）=[（0.629OD260-0.036OD280）×稀釋倍數(shù)（μg/mL）]/樣重。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 花芽分化期假鱗莖內(nèi)可溶性糖含量的變化

由圖1可知，假鱗莖中可溶性糖含量變化呈先下降后上升的趨勢。9月17日可溶性糖含量為259.88 μg/g FW，9月17日到11月4日，可溶性糖的含量略有下降，下降約3.3%。11月4日～翌年3月28日，假鱗莖內(nèi)可溶性糖的含量幾乎呈直線上升，3月28日可溶性糖的含量達(dá)到410.72 μg/g FW，是9月17日的1.65倍、11月4日的1.7倍。表明可溶性糖含量在黃花美冠蘭花芽分化過程中代謝旺盛，為花芽分化提供大量能量及結(jié)構(gòu)物質(zhì)。

2.2 黃花美冠蘭花芽分化過程中假鱗莖內(nèi)可溶性蛋白含量的變化

由圖2可知，假鱗莖中可溶性蛋白的含量總體呈上升趨勢。9月17日可溶性蛋白含量為17.53 μg/g FW，9月17日～11月4日含量略有下降，下降僅2.8%，11月4日～12月22日可溶性蛋白含量急劇上升，12月22日含量高達(dá)44.53 μg/g FW，上升了161.5%，12月22日～翌年3月28日呈緩慢上升趨勢，翌年3月28日可溶性蛋白質(zhì)含量為52.03 μg/g FW，僅比12月22日上升了16.8%?？扇苄缘鞍自?2月22日以后代謝趨緩，表明此時花芽分化結(jié)構(gòu)物質(zhì)的合成與組配趨于動態(tài)平衡。

2.3 花芽分化過程中假鱗莖內(nèi)C/N的變化

由圖3可知，9月17日～11月4日，黃花美冠蘭假鱗莖內(nèi)C/N略有下降，但維持在較高水平，9月17日和11月4日C/N分別為14.23和14.15，11月4日～12月22日C/N急劇下降，12月22日C/N僅6.98，較9月17日下降約51.4%，12月22日～翌年3月28日C/N緩慢上升，至翌年3月28日C/N為7.89，較12月22日上升約13.1%。

2.4 花芽分化期假鱗莖內(nèi)核酸含量的變化

由圖4可知，假鱗莖內(nèi)總核酸含量呈先降低后升高再降低的變化趨勢，且波動幅度較大；9月17日假鱗莖內(nèi)核酸含量為0.091 μg/g FW，11月4日為0.042 μg/g FW，下降約53.8%，11月4日～翌年2月8日核酸含量迅速上升，2月28日核酸含量高達(dá)0.108 μg/g FW，較11月4日上升約157.1%，2月8日至3月28日核酸含量急劇下降，3月28日核酸含量僅0.030 μg/g FW，較2月8日下降約72.2%。

3 討論與結(jié)論

大量的實(shí)驗(yàn)證明，碳水化合物在植物開花中具有重要的作用。Bodson等[17]研究發(fā)現(xiàn)在幾種長日和短日植物中，蔗糖和可溶性糖的含量在花芽分化階段均呈逐漸升高的趨勢。鄭煥娣等[18]研究發(fā)現(xiàn)香莢蘭[Vanilla fragrans（Salisbury） Ames]花芽分化期至花芽萌發(fā)期需要相對較高的可溶性糖總量。羅充等[19]研究表明草莓的花芽分化會大量消耗碳水化合物，在花芽分化初期可溶性糖、還原糖和淀粉含量下降。本試驗(yàn)中黃花美冠蘭假鱗莖內(nèi)可溶性糖含量變化與前人試驗(yàn)結(jié)果相似，可溶性糖含量先緩慢下降，可能與假鱗莖內(nèi)與花芽分化的相關(guān)代謝活動啟動有關(guān)，之后可溶性糖含量迅速上升，可能與淀粉等能量貯藏物質(zhì)分解有關(guān)，為花芽分化提供足夠的能量供應(yīng)。

假鱗莖是黃花美冠蘭初期生長的主要營養(yǎng)供應(yīng)器官，在花芽分化之前已經(jīng)積累大量的營養(yǎng)物質(zhì)?；ㄑ糠只某跗谝拇罅康牡鞍踪|(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)物質(zhì)的重組，因此，表現(xiàn)出初期可溶性蛋白質(zhì)含量下降的趨勢。花芽分化開始后，大量結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)不斷轉(zhuǎn)化，使得可溶性蛋白質(zhì)含量迅速上升。而花芽分化中后期，可溶性蛋白含量上升趨勢變緩，但仍維持在相對較高的水平，表明在花芽分化后期仍需要大量的蛋白質(zhì)。孫乃波等[20]在對草莓品種‘北輝的研究中發(fā)現(xiàn)在花芽分化過程中葉片中可溶性蛋白的含量呈先下降后上升的變化趨勢，與黃花美冠蘭的變化相似，不同之處在于黃花美冠蘭假鱗莖內(nèi)可溶性蛋白含量上升更為迅速。

碳氮比假說認(rèn)為，C/N高促使植物進(jìn)行花芽分化，本試驗(yàn)中9月17日～11月4日黃花美冠蘭假鱗莖內(nèi)C/N維持在較高水平，說明黃花美冠蘭花芽分化的啟動需要較高的C/N，隨后C/N迅速下降，到12月22日降到最低，可能是大量結(jié)構(gòu)物質(zhì)合成消耗糖類同時可溶性蛋白質(zhì)增加所致，12月22日～翌年3月28日，C/N平緩上升，但維持在相對較低的水平，表明假鱗莖內(nèi)維持一定C/N對黃花美冠蘭的成花過程有利。

核酸是生物最基本的遺傳物質(zhì)，貯存了細(xì)胞所有的遺傳信息，并控制蛋白質(zhì)的生物合成，因此，核酸是代謝和發(fā)育方向的主導(dǎo)者。在果樹研究中，花芽分化與核酸代謝有關(guān)[14]。從本試驗(yàn)結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)在整個花芽分化過程中假鱗莖內(nèi)總核酸含量呈高-低-高-低的變化趨勢。起初核酸含量高可能是生理分化時期細(xì)胞內(nèi)核酸代謝活躍所致，而后因生長錐體積增大而使核酸含量大幅下降，之后又大幅上升，多半與花芽各部形態(tài)建成使核酸代謝再度活躍有關(guān)，此后核酸含量又開始下降，可能與形態(tài)分化進(jìn)入尾聲所致，有研究表明，花芽分化期核酸含量的變化主要體現(xiàn)在RNA上[21]，當(dāng)形態(tài)分化進(jìn)入尾聲時，先前合成的大量RNA分解，從而導(dǎo)致核酸含量下降，但由于本試驗(yàn)未測定DNA和RNA含量變化，因此具體變化特征尚需進(jìn)一步研究。

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