馮冬林　許端詳　高山

摘 要 構(gòu)建并篩選苦瓜成熟果實(shí)cDNA文庫，分離獲得2個(gè)全長cDNA序列（命名為McRABD2c和McAGD8）。序列分析結(jié)果表明：McAGD8長度為1 695 bp，含有1個(gè)1 209 bp開放閱讀框，編碼403個(gè)氨基酸，該蛋白含有1個(gè)保守的Arf GAP結(jié)構(gòu)域，與黃瓜CsAGD8-like具有90%的同源性，同甜瓜CmAGD8具有89%的同源性。McRABD2c長度為1 166 bp，含有1個(gè)609 bp開放閱讀框，推測編碼202個(gè)氨基酸，該蛋白含有Rab家族保守的RabSF（RabSF1-RabSF4）模體及特有的RabF模體（RabF1-RabF5）；5個(gè)G結(jié)構(gòu)域和2個(gè)構(gòu)象變構(gòu)域（SwitchⅠ、SwitchⅡ）及C末端的CCX序列，同CsRABD2C-like同源性高達(dá)99%。氨基酸同源比對(duì)及進(jìn)化分析結(jié)果表明McRABD2屬于小G蛋白，而McAGD8屬于Arf小G蛋白下游的效應(yīng)基因。

關(guān)鍵詞 苦瓜；McRABD2c；McAGD8；序列分析

中圖分類號(hào) Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Constructing and screening the ripe fruit cDNA library of Momordica charantia， Two full-length cDNA was isolated and designated as McAGD8 and McRABD2c separately. Sequence analysis showed that the McAGD8 is 1 695 bp in length with a complete 1 209 bp ORF and a Arf GAP domain， and encodes 403 amino acids. The comparison of deduced amino acids sequence revealed that the McAGD8 with 90% and 89% similarity respectively to the CsAGD8-like of cucumber and CmAGD8 of melon. The McRABD2c is 1 166 bp in length with a complete 609 bp ORF， and encodes 202 amino acids. McRABD2c protein included conserved RabSF（RabSF1-RabSF4）and RabF（RabF1-RabF5）motif of Rab GTPases subfamily， and five signature motif of phosphate loop（G1-G5）， two conformational switch（SwitchⅠ、SwitchⅡ）and C-terminal cysteines motif CCX. The McRABD2c showed 99% similarity with CsRABD2C-like of cucumber. Amino acids similarity and phylogenetic analysis indicated that McRABD2c is a small GTP-binding protein of Rab family， McAGD8 is a downstream effector of small GTP-binding protein Arf family.

Key words Momordica charantia； McRABD2c； McAGD8； Sequence analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.006

小G蛋白（small GTPases）是一類普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)的單體GTP結(jié)合蛋白，屬于RAS超家族。該家族成員具有高度保守的結(jié)構(gòu)及GTPases水解活性。小G蛋白家族成員眾多，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的相似性可以分為Ras、Rab、Rho、Arf和Ran 5個(gè)不同的亞族[1]。

Rab GTPases家族是小G蛋白家族中最大的一個(gè)成員，廣泛分布于從酵母、植物、植物及人類的真核生物中。植物Rab家族由8個(gè)亞族組成，命名為RabA、RabB、RabC、RabD、RabE、RabF、RabG、RabH。已有研究結(jié)果表明，Rab家族蛋白參與不同的運(yùn)輸途徑，包括內(nèi)吞作用、細(xì)胞質(zhì)分裂、后高爾基體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)膜和液泡[2]。還參與植物生長發(fā)育過程，如胚胎發(fā)育、花粉管萌發(fā)、根毛發(fā)育等和各種脅迫應(yīng)答反應(yīng)[3-9]。

小G蛋白在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮“分子開關(guān)”作用，通過上游鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）將非激活態(tài)（GDT-bound）小G蛋白激活為激活態(tài)（GTP-bound），并通過與下游效應(yīng)子GAPs（GTPases activating proteins）將激活態(tài)的GTP水解為非激活態(tài)的GDP和Pi來調(diào)解小G蛋白周期循環(huán)[10]。ArfGAPs基因所含GAP結(jié)構(gòu)域，應(yīng)答激活A(yù)rf GTPase，其他結(jié)構(gòu)域參與蛋白-蛋白互作和蛋白-油脂互作[10-11]。同時(shí)ArfGAPs具有獨(dú)立的功能，ArfGAP1能夠增強(qiáng)衣被蛋白的親和性，Glo3p-type ArfGAPs（Glo3p，ArfGAP2，ArfGAP3）參與動(dòng)物和酵母細(xì)胞內(nèi)衣被蛋白Ⅰ（COPⅠ）生物合成[12-16]。最新研究結(jié)果表明擬南芥中位于高爾基體的2個(gè)同源性較高的ArfGAP，AGD8和AGD9參與保持高爾基體形態(tài)，在植物生長發(fā)育中具有重要作用[17]。

苦瓜是一種重要的蔬菜作物，對(duì)苦瓜的一些重要調(diào)節(jié)基因的研究是有效開展苦瓜遺傳改良的重要基礎(chǔ)?？喙闲蛋白McRABD2c和小G蛋白下游效應(yīng)子基因McAGD8的克隆及序列分析，對(duì)研究苦瓜McRABD2c和McAGD8基因相關(guān)功能及相關(guān)信號(hào)通路奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

苦瓜cDNA文庫為本單位實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建?？喙喜牧蠟楦Ｖ菔惺卟丝茖W(xué)研究所育成品種佳玉。提取苦瓜成熟果實(shí)果肉RNA，并構(gòu)建cDNA文庫。

1.2 方法

基因克隆與序列分析：隨機(jī)挑取cDNA文庫陽性克隆，以M13R為測序引物，測序。將獲得的序列從GenBank（www.ncbi.nlm.gov）進(jìn)行同源比對(duì)。應(yīng)用DNAMAN軟件對(duì)基因序列及編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析；采用ExPaSy-PROSITE分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；ProtParam預(yù)測相對(duì)分子量和等電點(diǎn)；應(yīng)用Mega6.01軟件分別分析McRABAD2C、McAGD8同擬南芥相關(guān)基因蛋白序列，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜McRABD2c、McAGD8基因的克隆與序列分析

本研究從苦瓜cDNA文庫中分離獲得1個(gè)苦瓜小G蛋白（Rab）和1個(gè)Arf-GTPases激活蛋白陽性克隆。經(jīng)測序去除載體序列后表明cDNA長度分別為1 166 bp和1 695 bp，分別包含609 bp和1 209 bp的完整開放閱讀框，分別編碼202個(gè)和403個(gè)氨基酸的蛋白（圖1、圖2）。ProtParam預(yù)測McRABD2c分子量為22.551 5 ku，理論等電點(diǎn)為5.29；McAGD8分子量為43.396 2 ku，理論等電點(diǎn)為9.0。

2.2 蛋白序列分析

2.2.1 苦瓜McRABD2c保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析

分析苦瓜McRABD2c氨基酸序列結(jié)果表明：該基因具有GTP/Mg2+結(jié)合位點(diǎn)及GDI和GEF互作位點(diǎn)；Rab-GTPases家族保守的RabSF模體（RabSF1-RabSF4）；Rab亞家族蛋白所特有的RabF模體（RabF1-RabF5）；參與GTP/Mg2+結(jié)合和GTP水解的G結(jié)構(gòu)域（G1box-G5box）；兩個(gè)構(gòu)象變構(gòu)域（SwitchⅠ和SwitchⅡ）。C末端具有與異戊二烯化相關(guān)的CCX序列，有利于增強(qiáng)Rab蛋白的疏水性并促進(jìn)C端與細(xì)胞膜相連，該序列在Rab小G蛋白調(diào)節(jié)囊泡運(yùn)輸具有重要的作用（圖3）。

BLASTP序列比對(duì)結(jié)果顯示，McRABD2c與黃瓜CsRABD2C-like（XP_004148356.1）同源性高達(dá)99%，同川桑MnRABD2C（EXC02066.1）和黃瓜CsYPTM2（XP_004147230.1）具有97%的同源性，同百脈根LjRAB1C（CAA98160.1）和蘋果MdRABD2C（XP_

008369210.1）具有96%的同源性，因此推測McRABD2c為苦瓜RABD2C-like小G蛋白家族新成員（圖3）。

氨基酸序列McRABD2c與擬南芥小G蛋白家族基因經(jīng)Mega6 Clustal X聚類分析后，采用Neighbor-joining進(jìn)行1 000次bootstrap計(jì)算，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，McRABD2c與擬南芥小G蛋白R(shí)ab1進(jìn)化距離較近（圖4）。

2.2.2 苦瓜McAGD8保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析

氨基酸序列分析結(jié)果表明：苦瓜McAGD8含有1個(gè)Arf GAP結(jié)構(gòu)域，并含有1個(gè)C4類型的鋅指結(jié)構(gòu)（圖2），同時(shí)含有保守的CX2CX16CX2C結(jié)構(gòu)域（圖5），該結(jié)構(gòu)域能夠激活A(yù)TP 酶，調(diào)節(jié)囊泡運(yùn)輸。

BLASTP結(jié)果表明，該基因序列同黃瓜CsAGD8-like（XP_004148740.1）具有高達(dá)90%的同源性，同甜瓜CmAGD8（XP_008448682.1）具有89%的同源性，同葡萄VvAGD8-like（XP_002278066.2）具有80%的同源性，同大豆GmAGD8-like（XP_003531961.1）具有78%的同源性，同梅子PmAGD8（XP_008238246.1）具有77%的同源性。表明苦瓜McAGD8為苦瓜AGD8-like蛋白家族新成員（圖5）。

McAGD8與擬南芥AGD蛋白家族基因經(jīng)Mega6 Clustal X聚類分析后，采用Neighbor-joining進(jìn)行1 000次bootstrap計(jì)算，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，McAGD8與擬南芥AtAGD8蛋白進(jìn)化距離較近（圖6）。

3 討論與結(jié)論

迄今為止在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的93個(gè)小G蛋白中共有57個(gè)Rab GTPases[18-19]，是小G蛋白超家族中最大的家族，主要參與囊泡運(yùn)輸、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分泌、細(xì)胞信號(hào)調(diào)控等[20]。含有4個(gè)Rab1蛋白（AtRABD2a、AtRABD2b、AtRABD2c、AtRABD1）。同哺乳動(dòng)物中的Rab1和酵母中的Ypt1具有高度的同源性。已有研究結(jié)果表明，動(dòng)物中Rab1位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體的中間艙及高爾基體，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體間的跨膜運(yùn)輸[21-22]；酵母中的YPT1對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體間的跨膜運(yùn)輸起重要作用[23]；擬南芥中AtRABD2a的顯性失活突變體瞬間表達(dá)能夠?qū)晒飧患趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)上[24]；擬南芥AtRABD2b同植物生長發(fā)育相關(guān)，參與花期、衰老及脅迫調(diào)節(jié)，并參與ABA途徑[25]。

本研究中McRABD2c是從苦瓜成熟果實(shí)中獲得的，是否表明該基因參與了果實(shí)成熟過程的調(diào)控，與乙烯誘導(dǎo)途徑是否相關(guān)，是否參與了植物衰老過程及是否與逆境脅迫相關(guān)等還有待于進(jìn)一步研究確認(rèn)。

所有小G蛋白包括ArfGTPases從激活態(tài)（GTP-bound）到非激活態(tài)（GDT-bound）之間的循環(huán)過程需要下游效應(yīng)子的調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)ArfGTPases的效應(yīng)子即是ArfGAPs（AGD）。擬南芥含有15個(gè)AtAGDs，共分為4組，具有跨膜運(yùn)輸?shù)墓δ?。AGD8為第二組成員，含有1個(gè)Arf GAP結(jié)構(gòu)域，并含有1個(gè)C4類型的鋅指結(jié)構(gòu)，同時(shí)含有保守的CX2CX16CX2C結(jié)構(gòu)域[19]。已有研究結(jié)果表明該基因位于高爾基體[26-27]，功能作用到目前為止還不清楚。本研究克隆并分析McAGD8基因生物信息，為進(jìn)一步分析基因功能，并進(jìn)一步揭示該基因調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的分子機(jī)制提供一定的研究基礎(chǔ)。

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