崔興華　韓毅科　杜勝利　魏愛民　陳正武　劉楠

摘要：為了改變現(xiàn)有的田間檢測周期長以及受氣候條件影響的弊端，建立一種高效、準(zhǔn)確的純度檢測方法，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對黃瓜新品種‘津優(yōu)401種子的純度鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明：在備選的100對引物中有12對引物在親本間出現(xiàn)多態(tài)性互補(bǔ)的條帶，尤其引物N67和N87，由于它們的特異性強(qiáng)、條帶清晰的特點(diǎn)以及與田間鑒定的高度吻合被選為鑒定‘津優(yōu)401黃瓜新品種種子純度的標(biāo)記引物，從而將以往該品種種子純度鑒定的時間從2～3個月縮短到4～5h。

關(guān)鍵詞：黃瓜；‘津優(yōu)401；純度；SSR標(biāo)記

黃瓜是我國保護(hù)地種植面積最大的蔬菜之一，一年內(nèi)可以多茬栽培，需種量大，供應(yīng)期長。隨著人民需求的多樣化，對黃瓜品種類型的需求也逐漸趨向多種多樣，因此育種單位要根據(jù)不同地區(qū)的需求進(jìn)行定向的育種和繁育籽種。這樣不僅增加了育種單位育種工作量，同時也加大了育種單位保證種子質(zhì)量的難度，而種子的純度作為衡量種子內(nèi)部質(zhì)量重要的指標(biāo)之一也越來越受到種子生產(chǎn)單位和使用者的重視。既準(zhǔn)確又快速的鑒定商品種子純度的方法成為種子銷售前保證種子質(zhì)量的關(guān)鍵。

近些年隨著分子標(biāo)記技術(shù)的研究深入，使得利用分子標(biāo)記來對黃瓜商品種進(jìn)行純度鑒定成為了一種快速、準(zhǔn)確的方法。天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司多年來致力于分子標(biāo)記在黃瓜種子純度鑒定上的應(yīng)用研究，逐步開發(fā)了一套完善的種子純度鑒定體系。‘津優(yōu)401是天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司黃瓜研究所最新研制的露地專用黃瓜新品種，為保證‘津優(yōu)401的商品種質(zhì)量，現(xiàn)以‘津優(yōu)401父本、母本以及‘津優(yōu)401為材料，利用SSR技術(shù)篩選‘津優(yōu)401的特異引物用于‘津優(yōu)401種子的純度鑒定。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

‘津優(yōu)401黃瓜及其父、母本。天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司培育品種。

1.2DNA提取

采用CTAB法提取種子基因組DNA。將‘津優(yōu)401及其父、母本種子分別放入恒溫箱內(nèi)催芽36h以上，取種子發(fā)芽的根尖部位1cm左右放置EP管內(nèi)，加入200μL CTAB提取液充分研磨、混勻，放置65℃水浴5min；加入200μL氯仿：異戊醇（24：1）倒置混勻；放置離心機(jī)中12000r·min^-1離心5min后取上清液100μL；向上清液中加入70μL異丙醇（-20℃）充分混勻，靜止5 min后，8000r·min^-1離心5min；倒掉上清液倒置風(fēng)干后加入1×TE溶解DNA。

1.3‘津優(yōu)401特異引物的篩選

以上述‘津優(yōu)401及其父、母本的基因組DNA為模板，按照表1所示的SSR擴(kuò)增體系以及表2所示的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，將變性劑加人擴(kuò)增產(chǎn)物變性后采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離。觀察父、母本以及‘津優(yōu)401的條帶位置篩選特異引物。

1.4‘津優(yōu)401特異引物的驗(yàn)證

隨機(jī)抽取100?！騼?yōu)401種子同時用篩選獲得的特異引物和田間種植進(jìn)行品種純度的鑒定，比較2種方法的鑒定結(jié)果，驗(yàn)證利用SSR技術(shù)進(jìn)行‘津優(yōu)401種子純度鑒定的準(zhǔn)確性，并將此方法應(yīng)用到商品種的純度鑒定當(dāng)中。

2.結(jié)果與分析

2.1‘津優(yōu)401特異引物的篩選

利用100對SSR引物對‘津優(yōu)401黃瓜新品種進(jìn)行特異引物的篩選。通過PCR擴(kuò)增以及電泳分離，在備選的100對引物當(dāng)中，有12對引物在親本之間表現(xiàn)為共顯性分離，‘津優(yōu)401的帶型表現(xiàn)為雙親的互補(bǔ)。在存在共顯性分離的12對SSR引物當(dāng)中有2對引物N67和N87（圖1）由于條帶清晰并且特異性強(qiáng)被選為鑒定黃瓜‘津優(yōu)401純度的特異引物。

2.2‘津優(yōu)401特異引物的驗(yàn)證

同時用上述篩選獲得的2對SSR引物采用分子標(biāo)記和田間栽培的方式對100?！騼?yōu)401種子進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果顯示SSR技術(shù)鑒定種子純度與田間鑒定方式的準(zhǔn)確度都能達(dá)到96%以上（表3）。

2.3‘津優(yōu)401商品種純度檢測

自‘津優(yōu)401黃瓜新品種育成銷售開始就采用SSR技術(shù)在室內(nèi)進(jìn)行種子的純度鑒定工作，并同時輔助田間鑒定進(jìn)行驗(yàn)證，2011年至今4年間累計使用SSR技術(shù)檢測‘津優(yōu)401商品種10t以上，大大縮短了從采種到銷售的時間，提高了效率，節(jié)約了資源。

3.討論

田間檢測雖然具有簡單、直觀以及便于觀察的優(yōu)點(diǎn)，但是也存在周期長、工作量大、成本高、容易受環(huán)境因素影響以及需要大量土地等缺點(diǎn)。人民大眾對黃瓜品質(zhì)的多樣化和多變性要求日漸強(qiáng)烈，使得育種單位在第一年繁育的籽種類型不一定滿足第二年人民大眾對黃瓜商品性的要求，因此育種單位必須找到一種快速、高效并且準(zhǔn)確的種子純度鑒定方法，使其能在當(dāng)年就能對種子純度鑒定后進(jìn)行籽種銷售。本研究利用SSR分子標(biāo)記的方法進(jìn)行黃瓜籽種的純度鑒定，結(jié)果表明在備選的100對引物中有2對引物（N67和N87）在‘津優(yōu)401和親本中能夠表現(xiàn)特異性明顯的多態(tài)性，并且通過與田間檢測的相互對比，準(zhǔn)確率極高。最后確定此兩對引物可以用于該品種的籽種純度鑒定。這樣就將原來的田間檢測的時間從2～3個月縮短至5-6h就能夠完成，最大程度的保證了該品種能夠及時投放市場，滿足人民群眾對黃瓜籽種的需求。

此外，天津科潤黃瓜研究所經(jīng)過多年的研究，將整個SSR分子標(biāo)記檢測體系在以往的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，在不影響檢測結(jié)果的前提下從檢測時間和檢測成本上都進(jìn)行了優(yōu)化。首先將人工研磨改為使用45孔研磨機(jī)進(jìn)行研磨，從以往人工研磨每樣20s縮短至45樣30s，效率提高近30倍；其次本研究將電泳分離膠從瓊脂糖凝膠改為聚丙烯酰胺凝膠，這樣點(diǎn)樣量從原來的每塊膠的20-40個樣擴(kuò)大到近1000個樣，效率提高了20倍以上；其三還通過優(yōu)化品種基因組DNA提取過程的離心和水浴時間，從原來的10min縮短至5min，時間節(jié)約了一半。通過這些技術(shù)上的改進(jìn)優(yōu)化檢測流程大大提高了檢測效率，不僅大量節(jié)約了檢測時間，同時也降低了檢測成本。