楊中周

摘要：種子的純度是種子質量的重要指標，其對產量及品質均有直接而明顯的影響。辣椒種子純度鑒定技術也由傳統的主要依賴形態(tài)鑒定逐步發(fā)展形成集形態(tài)學鑒定、細胞學鑒定、蛋白及同工酶電泳鑒定和遺傳標記鑒定等技術的鑒定技術體系，特別是基于DNA水平的分子標記技術為種子純度鑒定提供了一個新的途徑。對用于辣椒純度鑒定的幾種分子標記技術的基本原理及應用進行了概述，并全面闡述了各自的優(yōu)缺點，主要包括RFLP、RAPD、SCAR、SSR、ISSR、SRAP、SNP，旨在為辣椒分子純度鑒定提供參考。

關鍵詞：辣椒；純度檢測；SSR；ISSR；SNP

近年我國辣椒種植面積有130萬hm²之多，僅次于白菜類蔬菜；每年辣椒產量高達2800萬t，總產值居蔬菜之首。在當今辣椒生產中廣泛使用雜交種，而在實際的制種過程中，由于父母本混雜、母本自交、外來花粉干擾等均影響到種子純度進而影響辣椒的品質與產量。傳統的種子純度鑒定主要以田間植株的葉形、長勢、幼果鑒定為主，輔以苗期真葉POD同工酶電泳等方式。前者耗時較長，投入成本較高，而且還常受天氣等因素制約；后者雖然受外界因素影響小，鑒定準確可靠，但其譜帶少，差異有限，不能夠顯示出不同品種基因型間的差異。自1974年，Grodzicker等發(fā)明了RFLP（Re—striction Fragment Length Polymorphism，限帶性內切酶片段長度多態(tài)性）技術以來，迄今已有20多種分子標記技術相繼問世，部分已應用于農作物純度的檢測中。

1.限制性酶結合使用分子雜交技術的標記

1.1RELP（Restriction fragment length polymor-phism，限制性內切酶片段長度多態(tài)性）技術

這種基于酶切最早用于品種鑒定的第一代分子標記技術，主要通過DNA提取、限制性內切酶切割、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、southerri印跡雜交、放射自顯影、與標準RFLP指紋比較分析等幾個步驟對品種進行驗雜。RFLP標記大多為共顯性標記，具有特異性強、準確性高等優(yōu)點。Livneh等認為，RFLP技術可用于鑒別辣椒雜交種及其親本的種子和幼苗形態(tài)（而同工酶不能鑒別），如利用Hind III/Riho探針43可將雜種Capsicum annuum及其親本鑒別開來。然而其技術操作繁瑣、難度較大、耗費高，不適合大規(guī)模的商業(yè)鑒定，因此2年后Livneh等又將其改造成一個簡單適用的PCR反應。該項技術的諸多缺點極大地限制了其在種子純度鑒定中的應用。

2.經PCR擴增的標記

2.1RAPD標記（Randomly Amplified Polymor-phic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA）

該技術是以PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應）為基礎，以長度為9～10bp隨機寡聚核苷酸為引物對模板DNA進行PCR擴增，后經瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、溴化乙錠（EB）或銀染鑒定多態(tài)性。該技術在辣椒雜種鑒定中的研究較為普遍，詹玉絲等研究PCR反應的主要影響因子，建立適合辣椒RAPD分析的PCR反應體系，并用40個引物對‘豫椒968及其親本進行PCR擴增檢測，篩選出S5、S149、S187等3個有特異性的引物。在對以上3個引物進行重復篩選后，確定S149能用于此辣椒品種純度鑒定，用該引物擴增、電泳鑒定結果與田間鑒定結果完全吻合。柳李旺等用91個寡核苷隨機引物擴增‘02-16及其親本，但親本與雜交后代間差異不明顯，但通過引入外來品種，發(fā)現外來種與‘02-16有明顯區(qū)別，確定此類引物可以鑒定外來品種引起的機械混雜。經篩選引物N5能在父母本之間擴增出的特異帶存在著明顯區(qū)別，認為該引物可用于鑒定真雜種和由于母本自交引起的假雜種及外來品種的機械混雜。用該引物對代純度鑒定與田間鑒定、種子貯藏蛋白質鑒定、苗期真葉POD同工酶分析結果基本一致。李智軍等針對‘廣椒6號及親本，從340個RAPD隨機引物中篩選出用于反交種的純度鑒定的偏母型引物5個，用于正交種鑒定的偏父型引物4個，可用于正反交種兩者純度檢測的互補型引物6個。利用偏父型引物F05、105和互補型引物F15進行純度檢測，3個引物的檢測結果不但一致，而且與田間形態(tài)學鑒定結果吻合。黃三文等篩選出12個可用于‘中椒系列雜交種純度鑒定的RAPD標記。Hulya的研究也證實RAPD標記在辣椒純度鑒定中的可行性。但由于RAPD受條件影響大，重復性差，而且一般只表現顯性遺傳，不能有效區(qū)分顯性純合和雜合基因型等缺點，直接限制了其的發(fā)展。

2.2SSR標記（Simple Sequence Repeat或Micro-satellite DNA，微衛(wèi)星DNA）

它是由多為1～6個核苷酸串聯重復成100bp以內大小的DNA片段。由于微衛(wèi)星位點兩側的堿基序列較為保守，便于設計特定的引物，經體外擴增后的產物通過電泳技術進行分離，進而獲取這些重復序列的多態(tài)性信息。SSR標記多態(tài)性高、結果重演性和穩(wěn)定性好、操作高度自動化、不受環(huán)境影響、每個位點均有許多等位形式，且呈共顯性遺傳，與顯性遺傳相比，它可分辨出雜交種子的雜合體和純合體，是目前應用最為廣泛的分子標記技術，同時也是被普遍認為是最接近理想化的品種鑒定技術。特別是自2010年我國應用SSR分子標記開展品種真實性監(jiān)督抽查以來，越來越多的仲裁機構依靠該技術進行純度檢測，這也促使許多企業(yè)爭相效仿。

劉子記等從辣椒85對SSR引物中篩選出10對位于不同染色體上、能在‘熱辣3號親本間能擴增出互補特異性條帶的引物，且均為共顯性標記；然后用分別位于2、10、11號染色體上的多態(tài)性標記SSR27、SSR70、SSR76對196株‘熱辣3號單株及其親本材料進行PCR擴增，從擴增結果檢測其純度。該檢測結果與田間表型鑒定結果高度一致，表明SSR分子標記可用于‘熱辣3號雜交種純度的快速鑒定。張曼利用21對SSR引物對辣椒代及其雙親進行PCR擴增篩選，發(fā)現引物CA885在雙親和F₁代中存在多態(tài)性。且該引物擴增結果穩(wěn)定。利用CA885分別對2份辣椒品種F₁雜交種的96株單株進行純度檢測，結果分別為90.6%和86.0%。與田間純度檢測結果（分別為90.6%和91.3%）相近或稍低。

2.3SCAR（Sequence Characterized Amplified Regions，特定性片段擴增區(qū)域）標記

該技術于1993年由Paran和Michelmore在RAPD基礎上提出，其穩(wěn)定性和可重復性顯著提高，還具有快速、準確、成本低的特點，為品種分類與鑒定、假種辨別提供技術依據。陳靈芝等利用150條隨機引物對‘隴椒5號及其親本基因組DNA進行擴增，篩選出R520和R780兩條特異性引物，前者為父本和F₁特有標記，后者為母本和F₁特有標記。對可鑒別母本和F₁的R520擴增片段進行回收、克隆、測序，設計合成一對引物對試材進行擴增，鑒定出無條帶的母本或雜株。

2.4ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性）分子標記技術

該技術是由Zietkeiwitcz等于1994年基于SSR開發(fā)的、利用引物（SSR序列的3'端或5'端錨定1至數個隨機核苷酸）對位于反向排列、間隔不太大的重復序列間的基因組節(jié)段進行PCR擴增的一種分子標記。該技術遺傳多態(tài)性高、重復性好、DNA用量少、無需知道兩端的堿基序列，引物設計簡單、呈孟德爾遺傳，已被廣泛應用于種質鑒定，然而其在辣椒上的研究鮮有報道。徐杰從15條引物中篩選出10條重復性好、條帶清晰、多態(tài)性好的引物，并利用優(yōu)化后的ISSR-PCR反應體系對辣椒F₁代種子的DNA進行擴增，電泳圖譜結果表明，ISSR可以有效地從F₁種中分離出機械混雜或人工混雜的種子。然而該試驗未對F₁的親本DNA同時進行擴增分析，也未對結果進行后續(xù)田間驗證，因而未區(qū)分出真假雜交種和驗證結果的真實性。

2.5SRAP標記（Sequence-Related AmplifiedPolymorphism，相關序列擴增多態(tài)性）

該技術由美國加州大學Li博士等于2001年開發(fā)出的基于PCR對基因的ORFs（0pen Readinz Frames，開放閱讀框）的特定區(qū)域進行擴增的一種顯性分子標記技術。SRAP的一組由17個堿基組成的正向引物中使用“CCGG”序列，其目的是使之特異結合可譯框（ORFS）區(qū)域中的外顯子；SRAP中使用的由18個堿基組成的反向引物的3'端含有核心AATT，以特異結合富含AT區(qū)，比如啟動子和內含子等。這就使得內含子與外顯子有可能得到擴增。SRAP具有多態(tài)性豐富、引物可以通用等特點，與SSR相比其辨別能力更高、鑒定結果更接近田間種質鑒定，是一種高效的作物品種尤其是雜交種鑒定技術。扈新民等對SRAP分子標記反應體系進行優(yōu)化，確定最佳反應體系，并以‘杭椒4號及其父母本為供試材料檢測雜種一代純度，結果與田間農藝性狀調查驗證結果非常接近。

3.基于單核苷酸多態(tài)性（Single Nugle-otide PolymorphiSill，SNP）的分子標記

自1996年Lande首次將SNP作為一種新型分子標記提出，該技術越來越受到國內外學者的重視，目前已經成為最具應用前景的分子標記。SNP標記主要是由單堿基的插入、缺失、轉換及調換等引起的基因組核苷酸序列多態(tài)性，具有二態(tài)性、等位基因性、密度高、遺傳穩(wěn)定、易實現分析的自動化等特點。Jung等篩選出可以用于辣椒品種鑒定的40個AS-PCR SNP標記，從而將81個商品種中的79個區(qū)分開來，同時也能完全區(qū)分出供試的17個甜椒品種。Jeong等俐用SNP-HRM技術對辣椒屬6個種的31個成員進行辣椒種質資源研究，發(fā)現通過對6種COSII標記曲線的結合比較分析可有效將他們歸到其所屬的種，這與當今的分類系統完全吻合，從而表明該項技術可快速鑒別新種質。這些科研成果對鑒定外來品種的機械混雜具有一定的借鑒意義，然而應用該項技術對辣椒真雜種和由于母本自交引起的假雜種的鑒定鮮有報道。國內外該項技術的研究雖僅限于西瓜、甜瓜與黃瓜，然而這些寶貴的經驗卻為判斷辣椒種子是否存在親本污染，進而測試出供試品種的種子純度的相關研究創(chuàng)造了條件。

4.應用前景與展望

理想的純度檢測方法應具備穩(wěn)定性好、技術簡單、快速、經濟、便于標準化操作等特點。而就目前常用的幾種分子標記而言，RFLP操作復雜，對DNA質量要求高，費用較高，放射性同位素對人體有害；RAPD結果重復性較差；SSR引物開發(fā)費用高；SNP存在專利問題，對遺傳統計的方法及工具要求高，開發(fā)、檢測費用大等。均未達到理想的檢測方法的要求。

2014年1月韓國首爾大學的Kim等對墨西哥一個辣椒栽培變種的全基因組序列和裝配進行了報道，并報道了2個栽培辣椒基因序列及一個野生黃燈籠椒從頭測序序列；在此基礎上獲得首個高質量的參考基因組，并鎖定了負責產生辣椒素的基因。同年3月Qin等報道了遵義市農業(yè)科學研究院選育的品種‘遵辣1號和一個墨西哥野生種的全基因組序列。這些在辣椒領域的科研進展將會促使SSR引物開發(fā)費用逐漸降低。就ISSR標記而言，其引物具有良好通用性，引物設計費用低。此外，兩者兼具操作簡單、穩(wěn)定性好等特點，使其基本滿足辣椒純度檢測的要求。

近年來，公共序列數據庫（NCBI）中大量快速增長的EST（Expressed Sequence Tags，表達序列標簽）序列資源與辣椒多態(tài)性EST-SSR標記的位點鑒定及引物研究為SSR標記的開發(fā)提供了新途徑。目前EST-SSR分子標記技術已在南瓜、黃瓜、大白菜等作物純度鑒定上成功應用。該項技術具有過程簡單、成本低、在相關物種間具有較高的可轉移性等特點，再加上SSR位點在轉錄區(qū)的發(fā)生頻率遠高于非轉錄區(qū)的優(yōu)勢，使得該項技術更高效，有較好的應用前景。同時隨著高通量測序技術和生物信息學的發(fā)展，海量SNP數據被提交至數據庫并共享，為建立精確、快速、高通量和高度自動化的辣椒種子純度SNP鑒定體系創(chuàng)造了條件。

在實際工作中，往往要等到供試材料長出葉片后再進行提取，而且采用不同的方法（商業(yè)DNA提取試劑盒、CTAB法、SDS法以及其改良后的一些方法）提取的速度及質量也略有差異。這些都是制約鑒定效率的重要因素。如果能從干辣椒種子中快速提取DNA并形成標準化的操作流程和技術體系，這將大大縮短鑒定所需時間，提高工作效率。