蓋江濤　陳振璽　王鵬

摘 要 苯丙氨酸解氨酶（PAL，phenylalanine ammonia-lyase[EC：4.3.1.24]）是植物次生代謝尤其是苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶，與植物抵抗病原菌入侵密切相關(guān)，具有重要的植物生理學(xué)意義；其催化產(chǎn)物是辣椒素等植物天然產(chǎn)物的前體。采用BLASTP方法，依托全基因組數(shù)據(jù)庫，獲得了番茄、馬鈴薯、本氏煙草、辣椒等4種茄科植物及楊樹、擬南芥的PAL基因家族成員共27條序列，并對其進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析、理化性質(zhì)分析及結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明：在進(jìn)化過程中，茄科植物煙草、番茄、馬鈴薯和辣椒的親緣關(guān)系較近，擬南芥、楊樹與茄科植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；酸性蛋白質(zhì)占96.3%，所有蛋白均為親水性穩(wěn)定蛋白、有明顯跨膜現(xiàn)象、無信號肽；所有PAL亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中，具有活性位點(diǎn)的蛋白占96.3%。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究茄科植物中PAL代謝機(jī)理提供理論支持。

關(guān)鍵詞 苯丙氨酸解氨酶；PAL；基因家族；氨基酸；茄科

中圖分類號 Q949.777.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Phenylalanine ammonialyase（PAL， EC：4. 3. 1. 24）is a critical enzyme in secondary metabolism of plants， which has significant biological relevance and strong ability against bacteria； also， its product provides precursor for plant natural products such as capsaicinoids. In this study， based on the genome database， 27 peptide sequences belonging to phenylalanine ammonialyase gene family were obtained from Lycopersicon esculentum Mill. （syn. Solanum lycopersicum L.）， Solanum tuberosum L.， Nicotiana benthamiana Domin， Capsicum annuum L.， Populus trichocarpa L and Arabidopsis thaliana（L.）Heynh by BLASTP， and analysed by bioinformatics， physico-chemical properties， structural analysis. The analysis showed that tobacco， tomatoes， potatoes and peppers have close genetic relationship， then Arabidopsis thaliana， poplar is further in evolution. Acidic protein is 96.3%. All PAL proteins are located in cytoplasm， hydrophilic， stable， transmembrane， no signal， and 96.3% of the protein has the active site. The anaytical results provide data for the next study of Solanaceae metabolic mechanism.

Key words Phenylalanine ammonia-lyase；PAL；Gene family；Amino acid；Solanaceae

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.005

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC：4.3.1.24）是一種與植物抗病性相關(guān)的酶。它通過催化L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）脫氨生成肉桂酸和氨，進(jìn)而合成多種具有抗菌作用的產(chǎn)物，是植物體內(nèi)次生代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，其酶活性的高低與植物的抗病性密切相關(guān)[1]。

植物在遭受冷害[2-4]、傷害[5-6]和病原菌侵染[7]等情況下，PAL活性迅速上升。在馬鈴薯晚疫病[8]、茄子黃萎病[9]、煙草赤星病[10]及煙草受TMV浸染[11]的研究結(jié)果中都表明苯丙氨酸解氨酶活性變化和植物抗性關(guān)系密切。因此，PAL活性可作為植物抗逆境能力的一個(gè)生理指標(biāo)。

目前，有關(guān)PAL基因與茄科植物抗性的研究已有報(bào)道，如利用病原菌侵染番茄，植物感病后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)番茄品種的抗病性與其接種后體內(nèi)PAL酶活性變化呈正相關(guān)[12-14]；王萱[1]以不同抗性辣椒品種為材料，研究了辣椒白粉菌侵染過程中PAL與品種抗性之間的關(guān)系及不同葉位葉片組織內(nèi)PAL 活性變化，結(jié)果表明辣椒白粉病抗性與PAL活性呈正相關(guān)關(guān)系，且接種葉片的上、下位葉片組織中PAL活性也均提高，說明接種葉片受白粉菌侵染后會對相鄰非接種葉片產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性。此外，它的產(chǎn)物還是辣椒中辣椒素前體香蘭素胺（vanillylamine）合成的第一步關(guān)鍵酶[15]。

在模式植物擬南芥中，PAL基因家族有4個(gè)基因，分別為PAL1（AT2G37040）、 PAL2（AT3G53260）、 PAL3（AT5G04230）、 PAL4（AT3G10340）[16]。研究報(bào)道，PAL1、PAL2和PAL4基因在植物維管系統(tǒng)的木質(zhì)素合成過程中起作用，PAL3的作用較弱[16]，PAL1和PAL2也在類黃酮生物合成過程中有重要作用[17]。在楊樹中，PAL的活性主要在正在發(fā)育的木質(zhì)部、嫩莖和嫩葉中最高，而老莖和成熟葉中PAL的活性則很低[18]。

本研究以已知PAL基因功能的擬南芥 [Arabidopsis thaliana（Linnaeus）Heynhold]和楊樹[Populus trichocarpa Linnaeus]的PAL序列作為參考，以 4種基因組測序工作已經(jīng)完成的茄科（Solanaceae）植物番茄（Lycopersicon esculentum Miller， 異名Solanum lycopersicum Linnaeus）、馬鈴薯（Solanum tuberosum Linnaeus）、本氏煙草（Nicotiana benthamiana Domin）和辣椒（Capsicum annuum Linnaeus）作為研究對象，以其全基因組數(shù)據(jù)庫為依據(jù)，通過BLAST的方法獲得了這4種茄科植物PAL基因家族的全部序列，通過系統(tǒng)發(fā)育分析、理化性質(zhì)分析等生物信息學(xué)方法分析PAL基因，比較茄科植物中PAL基因家族的特性，為進(jìn)一步研究茄科植物中PAL基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫搜索

從phytozome V9.1（http：//www.phytozome.net）[19]、茄科植物基因組數(shù)據(jù)庫（http：//solgenomics.net/）中搜索得到擬南芥、楊樹、番茄、馬鈴薯、本氏煙草、辣椒的PAL基因信息，并下載數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列。

1.2 多序列比對分析

用MAFFT[20]軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多序列比對，比對結(jié)果保存為fasta格式，并于MEAG6.0[21]中對比對結(jié)果進(jìn)行手動調(diào)整。將調(diào)整后的序列保存為“.nex”格式以備后續(xù)分析。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

用Mrbayes3.1.2對序列進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，設(shè)置1 000 000代檢測，取樣頻率為1 000，4條Markov鏈，其余參數(shù)均為軟件默認(rèn)值，2次運(yùn)行，分裂頻率（Split frequencies）小于0.01時(shí)終止運(yùn)行。所得的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹在Figtree version 1.3.1軟件中進(jìn)行查看、編輯。

1.4 蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

用ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）[22]在線工具預(yù)測分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，應(yīng)用TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/software/TMP-

RED-form.html）在線分析來預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向，亞細(xì)胞定位應(yīng)用Cell-Ploc 2.0 package軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進(jìn)行在線分析。用TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）在線預(yù)測氨基酸序列導(dǎo)肽，在signalP 4.1 server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）中完成蛋白質(zhì)信號肽的預(yù)測。活性位點(diǎn)運(yùn)用在線分析軟件ExPASy（http：//prosite.expasy.org/）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAL基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過BLASTP的方法，去掉重復(fù)序列及結(jié)構(gòu)域不完整序列，共得到27條氨基酸序列，其中擬南芥4條、番茄6條、馬鈴薯5條、辣椒4條、本氏煙草3條、楊樹5條。對27條編碼PAL的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1）。由圖1可知，這27條PAL基因家族序列聚為明顯的2枝。擬南芥的4個(gè)PAL基因、楊樹的5個(gè)PAL基因、馬鈴薯的1個(gè)PAL基因、辣椒的2個(gè)PAL基因、本氏煙草1個(gè)PAL基因、番茄的1個(gè)PAL基因聚為一枝，說明在進(jìn)化過程中楊樹、擬南芥的親緣關(guān)系較近；而茄科植物番茄的5個(gè)PAL基因、馬鈴薯的4個(gè)PAL基因、辣椒的2個(gè)PAL基因、本氏煙草2個(gè)PAL基因聚為一枝，說明茄科植物的親緣關(guān)系較近，而且PAL基因的分化在這4種茄科植物物種形成前完成。

在已知的擬南芥PAL基因功能的前提下，可推測出與擬南芥最近的分枝上的5條基因可能具有與擬南芥PAL基因相似的功能，它們是：NbS000

08842g0012.1（本氏煙草）、Solyc05g056170.2.1（番茄）、 PGSC0003DMT400060308（馬鈴薯）、 CA12g15510（辣椒）、 CA05g20790（辣椒）。而另一分支上的13條PAL基因均屬于茄科植物，且在每個(gè)物種中均呈現(xiàn)低拷貝，推測這些基因在茄科植物的形成中具有重要的生理功能。

2.2 PAL蛋白的理化性質(zhì)分析

針對以上鑒定的27條氨基酸序列，筆者對其進(jìn)行了理化性質(zhì)分析。結(jié)果顯示：除Nbe__NbS000040

18g0009.1為弱堿性蛋白（理論等電點(diǎn)pI=7.29）外，其余蛋白均為酸性蛋白質(zhì)（理論等電點(diǎn)pI<7），占總蛋白的96.3%（圖2）；根據(jù)Guruprasad方法[23]表明，所有蛋白均為穩(wěn)定性蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)小于40）（圖3）；相對分子量除Nbe__NbS00035803g00

15.1為105.38 ku外，其余位于71.84～81.17 ku范圍內(nèi)（圖4）；所有蛋白均為親水性穩(wěn)定蛋白 （GRAVY<0），有明顯跨膜現(xiàn)象，均無信號肽。半衰期一致表現(xiàn)為：序列的N-端為甲硫氨酸（Met），在哺乳動物的活體中半衰期30 h，在酵母活體中半衰期大于20 h，在大腸桿菌的活體中半衰期大于10 h。

2.3 PAL氨基酸導(dǎo)肽預(yù)測和可靠性分析

導(dǎo)肽（leader peptide）是一段引導(dǎo)新合成的肽鏈進(jìn)入細(xì)胞器的識別序列[24]。在核糖體中合成的蛋白質(zhì)，只有在正確的細(xì)胞部位并裝配成結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)合體，才能參與細(xì)胞的生命活動。因此，導(dǎo)肽的預(yù)測和分析對了解蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位與功能作用途徑和機(jī)制有一定的意義。氨基酸序列導(dǎo)肽的預(yù)測結(jié)果顯示，27條氨基酸序列含有的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（Chloroplast transit peptide，CTP）、線粒體目標(biāo)肽（Mitochon drial targeting pep-tide，MTP）及分泌途徑信號肽（Signal peptide，SP）的分值均較低，僅煙草基因Nbe__NbS00

035803g0015.1具有線粒體目標(biāo)肽，其余氨基酸序列均沒有導(dǎo)肽（表1）。

2.4 PAL氨基酸序列的結(jié)構(gòu)分析

3 討論與結(jié)論

PAL是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝途徑第一步反應(yīng)的酶，是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，苯丙烷類代謝途徑的產(chǎn)物在植物生長發(fā)育過程中起著重要的作用，而這些物質(zhì)的含量總是與PAL基因的活性密切相關(guān)，因此，PAL基因?qū)χ参镉兄浅Ｖ匾纳硪饬x，并且也成為重要的研究對象。

本研究對擬南芥、楊樹、番茄、馬鈴薯、本氏煙草和辣椒6種植物共27條PAL基因家族蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示茄科植物本氏煙草、番茄、馬鈴薯和辣椒的親緣關(guān)系較近，擬南芥、楊樹與茄科植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；且鑒定到茄科植物的13條序列與擬南芥、楊樹的PAL基因分別在兩2個(gè)分支，推測這些基因可能在茄科植物的形成過程中發(fā)揮了特定的生理生化功能。

理化性質(zhì)分析得出茄科植物PAL基因家族表現(xiàn)出高度的一致性。酸性蛋白質(zhì)占96.3%，所有蛋白均為有明顯跨膜現(xiàn)象、無信號肽的親水性穩(wěn)定蛋白，且僅煙草基因Nbe__NbS00035803g0015.1具有線粒體目標(biāo)肽，其余氨基酸序列均沒有導(dǎo)肽。初步認(rèn)為4種茄科植物中PAL基因家族編碼的蛋白，不屬于膜蛋白或分泌蛋白，它們由游離的核糖體合成，進(jìn)入胞質(zhì)溶膠，參與細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)，推測在維持細(xì)胞內(nèi)離子環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)代謝過程中發(fā)揮著重要作用。

結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，本試驗(yàn)選定的27條PAL基因中，除 Can__CA12g15510無活性位點(diǎn)外，其余26條PAL基因編碼的蛋白均具有活性位點(diǎn)，從結(jié)構(gòu)上初步認(rèn)為這26條基因均屬于PAL基因家族。同時(shí)，所有PAL基因亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中，這與已有的PAL基因的亞細(xì)胞定位研究結(jié)果一致[25]，也進(jìn)一步說明PAL蛋白為非分泌蛋白，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用。

目前，雖有一些關(guān)于茄科植物中PAL基因的研究，但都是對PAL生化活性的研究報(bào)道，從茄科植物PAL基因家族層面分析PAL基因的系統(tǒng)進(jìn)化，并比較茄科植物中PAL基因的性質(zhì)，還未曾報(bào)道。本研究以4種茄科植物PAL基因家族為研究對象，對其序列結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、進(jìn)化進(jìn)行分析，為下一步研究茄科植物中PAL基因的功能提供了理論基礎(chǔ)，對今后更好地利用PAL基因?qū)η芽浦参镞M(jìn)行改造、增強(qiáng)茄科植物的抗性等有推動作用。

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