張曉蕾， 孫如寧， 楊小弟

(1.中國藥科大學 高等職業(yè)技術學院，江蘇 南京 211198；2.南京師范大學化學與材料科學學院，江蘇 南京 210097)

石墨烯量子點印跡傳感器檢測鹽酸羅哌卡因

張曉蕾1， 孫如寧1， 楊小弟2*

(1.中國藥科大學 高等職業(yè)技術學院，江蘇 南京 211198；2.南京師范大學化學與材料科學學院，江蘇 南京 210097)

采用熱聚合法合成石墨烯量子點，再將石墨烯量子點通過π-π作用吸附在聚鄰氨基苯酚膜表面，基于石墨烯量子點表面電化學印跡，制備石墨烯量子點-分子印跡傳感器檢測鹽酸羅哌卡因。同時采用原子力顯微鏡表征石墨烯量子點尺寸，示差脈沖伏安法研究印跡響應機理。安培I～t曲線法發(fā)現(xiàn)傳感器對鹽酸羅哌卡因的響應線性范圍為2.0×10-6～6.1×10-4mol/L，檢出限(S/N=3)為1.1×10-6mol/L，與未使用石墨烯量子點的分子印跡傳感器對比，石墨烯量子點-分子印跡傳感器的線性范圍變寬，檢出限降低，空白加標回收率為91.0%～101%。將傳感器用于血漿樣品中鹽酸羅哌卡因的檢測，測得其濃度為4.21×10-6mol/L，高效液相色譜法驗證顯示該方法的檢測結(jié)果可靠，可用于臨床樣品的檢測。

石墨烯量子點；分子印跡；鹽酸羅哌卡因；鄰氨基苯酚

圖1 鹽酸羅哌卡因的分子結(jié)構

羅哌卡因(Ropivacaine，RP)是瑞典Astra制藥公司研發(fā)的新型長效酰胺類局麻藥，主要用于外科麻醉和硬膜外阻滯麻醉，可用于各種手術，以及手術后或分娩后急性止痛[1]。麻醉劑用量直接影響麻醉作用效果，麻醉劑過量更有可能導致死亡，因此臨床常用注射劑鹽酸羅哌卡因(Ropivacaine hydrochloride,RH)(見圖1)含量的準確檢測，對有效控制麻醉劑用量具有重要意義。目前檢測羅哌卡因的主要方法有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等[2-4]。這些方法相對復雜，使用設備昂貴，而電化學法比較簡便,且目前使用電化學法檢測鹽酸羅哌卡因的研究尚無報道。

分子印跡是一種合成對某一特定分子(印跡分子)具有選擇性的聚合物的方法[5-6]。分子印跡聚合物內(nèi)部具有固定大小和形狀的孔穴，并具有確定排列的功能基團，其對模板分子的立體結(jié)構具有記憶功能。石墨烯量子點是尺寸小于100 nm的石墨烯片[7]，其顯著的量子限域和邊緣效應，使之呈現(xiàn)出多種新的物理和化學性質(zhì)[8-9]，可用于傳感器研制[10-11]。石墨烯量子點具有良好的電子遷移速率和化學穩(wěn)定性，有望成為電化學傳感器的理想電極材料[12-14]。本研究以鹽酸羅哌卡因為模板分子，鄰氨基苯酚為功能單體，使用分子印跡技術在石墨烯量子點表面電化學聚合印跡修飾玻碳電極制備傳感器(GQDs-MIP/GCE)，并將其用于鹽酸羅哌卡因的檢測。該方法操作簡單、檢測線性范圍寬、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，為臨床樣本中鹽酸羅哌卡因的檢測提供了一種新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI830C電化學工作站(上海辰華儀器公司)；VNS5型原子力顯微鏡(美國Veeco公司)，Agilent Technologies 1260 高效液相色譜儀(Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，Agilent 1260DAD檢測器)。

鹽酸羅哌卡因(RH,純度>99%，中國藥科大學藥劑實驗室)；檸檬酸(純度>99.5%)、鄰氨基苯酚(OAP)、抗壞血酸(國藥集團化學試劑有限公司)；鹽酸多巴胺(98%，阿拉丁試劑)；苯丙氨酸、色氨酸(上海惠興生化試劑有限公司)；血漿樣品(中國藥科大學藥劑實驗室)；甲醇(色譜純，美國Tedia公司)；其余均為分析純試劑，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 石墨烯量子點的合成 石墨烯量子點(GQDs)的合成使用 “從下至上”的方法[15]。稱取2 g檸檬酸置于20 mL燒杯中，在控溫電熱套中加熱至200 ℃，保持恒溫，在5 min內(nèi)檸檬酸融化成無色液體再轉(zhuǎn)變成淡黃色，在30 min內(nèi)變成橙色時得到石墨烯量子點，加入10 mL水充分攪拌30 min得到石墨烯量子點貯備液，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 石墨烯量子點印跡電極的制備 玻碳電極依次用1.0，0.3，0.05 μm的氧化鋁粉拋光，在水和無水乙醇中分別超聲洗滌5 min，并重復3次，進行電化學拋光處理，在0.5 mol/L的H2SO4中于-0.3～1.5 V進行循環(huán)伏安電化學處理，直至獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應。

圖2 GQDs-MIP/GCE電極制備過程示意圖

如圖2所示，電化學聚合在含有50 mmol/L 鄰氨基苯酚(OAP)的1 mol/L H2SO4和0.5 mol/L NaSO4溶液中進行，用循環(huán)伏安法掃描10次，掃描范圍-0.2～0.8 V，掃描速率100 mV/s，在玻碳電極表面形成導電聚合膜，得聚鄰氨基苯酚膜修飾電極。

取1 mL 0.2 g/mL GQDs貯備液稀釋10倍，將聚鄰氨基苯酚膜(POAP)修飾電極浸入稀釋后的GQDs溶液中6 h，待GQDs充分吸附于膜表面后取出，用水清洗電極表面得POAP-GQDs修飾電極。

在0.2 mol/L NaCl介質(zhì)中，以5 mmol/L RH為模板分子，25 mmol/L 鄰氨基苯酚為功能單體，在GQDs表面采用“致孔劑印跡技術”[16-17]電化學印跡聚合，循環(huán)伏安法掃描30次，掃描范圍-0.2～1.2 V，掃描速率50 mV/s，使印跡聚合膜沉積在電極表面，再用0.5 mol/L的H2SO4溶液洗滌12 h，除去聚合物基質(zhì)中的RH，制成保留有模板分子構型孔穴的石墨烯量子點印跡(GQDs-MIP/GCE)電極。

1.2.3 石墨烯量子點無印跡電極的制備 實驗步驟與“1.2.2”同，在印跡聚合液中不加入模板分子RH，即制得石墨烯量子點無印跡(GQDs-NIP/GCE)電極。

1.2.4 未摻雜石墨烯量子點印跡電極的制備 除電極不浸入GQDs溶液中，其它實驗步驟與“1.2.2”相同，即制得無石墨烯量子點印跡(MIP/GCE)電極。

1.3 電化學測量

電化學測量在傳統(tǒng)三電極電化學池中進行，分別以GCE，GQDs-MIP/GCE，GQDs-NIP/GCE，MIP/GCE電極為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極。采用循環(huán)伏安法表征電極表面的修飾膜，支持電解質(zhì)為含有0.1 mol/L KNO3的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6(1∶1)溶液，電位掃描范圍-0.1～0.6 V，掃描速率50 mV/s。用示差脈沖伏安法表征電極印跡效應，掃描速率為20 mV/s，脈沖振幅為50 mV，脈沖寬度為50 ms，安培I～t曲線法研究電極性能，電解質(zhì)溶液均為含有0.1 mol/L KNO3的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)的PBS緩沖溶液(pH 7.4)。

1.4 血漿樣品處理

將血漿樣品離心，取上層清液與甲醇按照體積比1∶3充分混合，在5 ℃以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心分離7 min后，取上層清液定容。

圖3 GQDs 的原子力顯微鏡圖

1.5 高效液相色譜條件

流動相為甲醇-水(40∶60)，加入磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)流動相pH值至3.8，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長215 nm，柱壓182 bar。

圖4 4種電極在含0.1 mol/L KNO3的5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(1∶1)溶液中的循環(huán)伏安圖

圖5 酸性介質(zhì)中聚鄰氨基苯酚膜的結(jié)構

2 結(jié)果與討論

2.1 原子力顯微鏡表征GQDs

本實驗通過檸檬酸分子的熱聚合生成石墨烯量子點。如圖3所示，所制得GQDs粒徑控制在20 nm左右，與文獻[15]一致。

2.2 修飾電極的電化學表征

采用循環(huán)伏安法表征電極膜的導電性能。圖4為4種不同電極在含0.1 mol/L KNO3的5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(1∶1)溶液中的循環(huán)伏安圖。圖4a是裸玻碳電極表面[Fe(CN)6]3-/4-離子氧化還原反應的循環(huán)伏安曲線，鄰氨基苯酚在H2SO4酸性介質(zhì)(pH<3.0)中電聚合成均勻的導電聚鄰氨基苯酚膜(膜結(jié)構見圖5)[18]，[Fe(CN)6]3-/4-離子在聚鄰氨基苯酚膜(POAP)修飾電極表面的循環(huán)伏安曲線見圖4b。石墨烯量子點由于π-π堆積作用吸附在聚鄰氨基苯酚膜表面，因石墨烯量子點具有優(yōu)良的電子遷移速率，可以觀察到電極表面循環(huán)伏安曲線的氧化還原電流增強(圖4c)，說明電極在吸附石墨烯量子點后，其導電性能增強。然而在中性NaCl介質(zhì)中，分子印跡溶液中的功能單體鄰氨基苯酚電聚合成均勻的非導電性聚合膜，則電極表面循環(huán)伏安曲線的氧化還原電流明顯減弱(圖4d)。

圖6 GQDs-MIP/GCE(a,b)與GQDs-NIP/GCE(c,d) 電極對RH響應的示差脈沖伏安圖

2.3 傳感器印跡效應

未加模板分子的GQDs-NIP/GCE電極經(jīng)0.5 mol/L H2SO4洗脫后，在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的示差脈沖伏安曲線(見圖6c)無明顯的峰電流。再加入0.04 mmol/L RH后，仍未觀察到顯著的峰電流(圖6d)，由此可以證明未印跡電極對RH無響應。

2.4 檢測溶液pH值的影響

因RH的pKa為8.1，在堿性較強溶液中易發(fā)生沉淀，而溶液酸性較強可能會阻礙RH分子進入空穴形成氫鍵。實驗考察了檢測溶液pH值在5.8～7.6范圍內(nèi)時傳感器對0.01 mmol/L RH的響應。溶液pH值從5.8增加到7.3時，傳感器響應電流逐漸增大，在7.3～7.5之間，傳感器響應電流值達到最大，而從pH 7.5繼續(xù)增加到pH 7.6時，響應電流值開始降低，繼續(xù)增大溶液pH值，RH開始沉淀，無法再檢測。同時考慮到人體血液pH值在7.35～7.45之間，故選擇pH 7.4的PBS緩沖溶液為檢測底液。

圖7 GQDs-MIP/GCE(a) 與MIP/GCE 電極(b) 對RH的響應曲線

2.5 傳感器線性范圍及檢出限

在pH 7.4的PBS緩沖溶液中，應用安培I～t曲線法測定GQDs-MIP/GCE和MIP/GCE電極對不同濃度RH的響應(如圖7所示)。對比其響應曲線，結(jié)果顯示，加入GQDs后增強了電子傳導速率以及電極表面對檢測物的富集，使得GQDs-MIP/GCE的電極響應信號更靈敏，線性范圍更寬。RH濃度在2.0×10-6～6.1×10-4mol/L范圍內(nèi)與電流變量有良好線性關系(圖7插圖)，線性方程為ΔI(μA)=0.803 2c(mmol/L)-0.504 0(r2=0.993 1)，檢出限(S/N=3)為1.1×10-6mol/L。

2.6 傳感器的重現(xiàn)性、抗干擾性及穩(wěn)定性

在相同實驗條件下，用同1支GQDs-MIP/GCE電極對0.01 mmol/L RH平行測定6次，響應值的相對標準偏差(RSD)為2.3%；用相同方法修飾6支電極，并分別測定0.01 mmol/L RH，其RSD為2.4%。

實驗還考察了血液中部分生物分子和常見無機鹽離子對傳感器檢測RH的干擾情況。相同實驗條件下，濃度均為0.01 mmol/L的鹽酸多巴胺、抗壞血酸、苯丙氨酸、色氨酸、葡萄糖以及無機磷、Na+， Mg2+，K+，Ca2+，Cl-離子均無干擾(RSD<5%)。結(jié)果表明，此方法的抗干擾性較好。

經(jīng)實驗研究，使用過的電極用0.5 mol/L H2SO4洗滌10 min即可使電極基本恢復至響應前的狀態(tài)，并可得到重現(xiàn)的響應值。將電極放在4 ℃冰箱保存7 d后，其對RH的響應值仍保持在初始值的90.1%。以上結(jié)果表明傳感器具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.7 空白加標回收實驗

在0.1 mol/L KNO3的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)PBS緩沖溶液(pH 7.4)中，采用標準加入法測定RH的回收率，結(jié)果如表1所示。空白加標回收率為91.0%～101%，RSD為1.3%～2.1%，此結(jié)果說明空白基質(zhì)干擾較小，該方法準確度較好。

表1 空白加標回收率及相對標準偏差

2.8 實際樣品的檢測

為考察方法實用性，將傳感器用于血漿樣品中RH的檢測，測得樣品中RH濃度為4.21×10-6mol/L，RSD(n=6)為3.1%。同時采用高效液相色譜法檢測相同血漿樣品，測得樣品中RH濃度為3.99×10-6mol/L，RSD(n=6)為2.9%。由此可以證明應用電化學方法測量的可行性。

3 結(jié) 論

本文將石墨烯量子點材料與分子印跡技術結(jié)合，研制了檢測RH的GQDs-MIP/GCE電化學傳感器。該傳感器具有制備簡便、耗時短、線性范圍寬，選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定好等優(yōu)點，有望用于臨床樣本中RH含量的檢測。

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Determination of Ropivacaine Hydrochloride with Graphene Quantum Dots-Molecularly Imprinted Polymer Electrochemical Sensor

ZHANG Xiao-lei1，SUN Ru-ning1，YANG Xiao-di2*

(1.Higher Vocational College，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198,China；2.College of Chemistry and Materials Science，Nanjing Normal University，Nanjing 210097,China)

A novel electrochemical sensor for ropivacaine hydrochloride(RH) based on graphene quantum dots-molecularly imprinted polymer(MIP) modified glass carbon electrode was constructed.The graphene quantum dots(GQDs) were synthesized by the pyrolysis method,and adsorbed on the surface of conducting poly(o-aminophenol) membrane by π-π stacking，and then theo-aminophenol as functional monomer and RH as template molecule were electrochemically imprinted on the film of GQDs to develop the GQDs-MIP sensor.The average lateral size of GQDs characterized by atomic force microscope(AFM) is about 20 nm.The response mechanism of the resulting sensor was investigated by differential pulse voltammetry and the linear relationship of sensor was determined by means of amperometricI-tcurve.The results indicated that the calibration curve was linear in the range of 2.0×10-6-6.1×10-4mol/L，and the detection limit(S/N=3)was 1.1×10-6mol/L.Compared with the molecular imprinting sensor without GQDs，the GQDs-MIP sensor exhibited a wide linear range and a lower detection limit.The spiked recoveries were in the range of 91.0%-101%.The sensor was applied in the analysis of RH in plasma samples with RH concentration of 4.21×10-6mol/L.In contrast to the detection result of high performance liquid chromatography(HPLC) method，this electrochemical analytical approach is credible，and could be applied in the detection of RH in clinical samples.

graphene quantum dots(GQDs)；molecular imprinting；ropivacaine hydrochloride(RH)；o-aminophenol

2014-10-03；

2014-11-20

中國藥科大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(JKQZ2013010)

10.3969/j.issn.1004-4957.2015.02.006

O657.1；TQ460.72

A

1004-4957(2015)02-0159-05

*通訊作者：楊小弟，博士，教授，研究方向：環(huán)境分析，Tel:13951867138，E-mail：yangxiaodi@njnu.edu.cn