王立民(勝利石油管理局勝利醫(yī)院骨科，山東東營257055)

人參皂苷Rh2對人骨肉瘤細胞MG-63凋亡的影響

王立民△
(勝利石油管理局勝利醫(yī)院骨科，山東東營257055)

［摘要］目的:探討人參皂苷Rh2對人骨肉瘤細胞MG-63凋亡的影響，并初步探討可能的分子機制。方法:采用流式細胞術Annexin V-PI雙染法和MTT法檢測MG-63細胞的凋亡變化;免疫印跡法檢測Bcl-2、Bax、Cyt C和激活型caspase-3的蛋白水平。結果:流式細胞術和MTT法結果顯示人參皂苷Rh2呈濃度依賴性促進MG-63細胞的凋亡。免疫印跡法結果表明，與空白對照組相比，給藥組細胞Bax的蛋白表達顯著增加，Bcl-2的蛋白表達顯著減少，Bcl-2/Bax比值減少;線粒體中Cyt C蛋白表達顯著減少，而胞漿中表達顯著增加;激活型caspase-3蛋白水平顯著增加(P＜0.05)。結論:人參皂苷Rh2呈濃度依賴性促進MG-63細胞的凋亡，其凋亡過程可能與調控線粒體凋亡通路相關蛋白有關。

［關鍵詞］人參皂苷Rh2;人骨肉瘤細胞MG-63;細胞凋亡

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤之一，起源于骨間葉細胞，其瘤細胞具有形成骨質或腫瘤樣類骨質能力［1］，常見于10～20歲的青少年，發(fā)病率高，具有易復發(fā)，轉移快，預后差的特點［2］。年發(fā)病率約為0.03%，男女發(fā)病率約為1.5∶1［3］。大部分患者死于肺轉移［4］。早期單獨采用手術治療效果并不理想，近年來采用多種化學藥物聯(lián)合治療，對骨肉瘤的治療取得了一定程度的進展，但由于化療隨時間的進行易出現(xiàn)耐藥性，使得治療難以獲得預期效果。

人參是五加科多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)的名貴中草藥，具有悠久的藥用歷史和較高的藥用價值。大量研究證明，人參皂苷是其主要有效成分之一，其中人參皂苷Rh2具有顯著的抗腫瘤，增強免疫力等作用［5］。劉艷紅等［6］研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2具有誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的作用。本實驗將對人參皂苷Rh2對人骨肉瘤細胞MG-63的凋亡作用及其可能的分子作用機制進行研究。

材料和方法

1材料與試劑

人骨肉瘤細胞MG-63購于上海塞默科技生物發(fā)展有限公司;胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購于Gibco; MTT購于Sigma;線粒體分離試劑盒購于Thermo;抗Bcl-2、Bax、細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、cleaved caspase-3、β-actin和Cox IV的抗體均購于CST;其余試劑均為國產分析純。

人參皂苷Rh2單體購于吉林大學基礎醫(yī)學院有機化學教研室，采用DMSO溶解。

2實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)與分組人骨肉瘤細胞MG-63置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每1～2 d用0.25%胰酶消化傳代1次。設空白對照組(control)組，細胞不給予人參皂苷Rh2工作液處理;陰性對照組(DMSO組)，細胞中加入DMSO;給藥組分別給予人參皂苷Rh2工作液，使藥物作用終濃度分別為8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L和64 μmol/L。各組的DMSO與培養(yǎng)基的體積比均小于千分之一。

2.2流式細胞術檢測細胞凋亡各組細胞常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h使細胞周期同步化。用不含EDTA的胰蛋白酶消化并收集內皮細胞，離心后棄去上清液，沿管壁緩緩加入預冷70%乙醇，過夜。檢測前采用RNA酶消化，再加入Annexin V-PI染色液，4℃避光30 min，立即用流式細胞儀觀察細胞凋亡的情況。

2.3MTT法檢測MG-63細胞的存活率處于對數(shù)期生長的MG-63細胞用0.25%胰酶消化后，終止消化，再加入完全培養(yǎng)液并調整細胞濃度為1×108/L。接種于96孔板中，加藥后將各組置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后，加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩10 min，用酶標儀檢測488 nm處吸光度(A)。

2.4線粒體提取使用線粒體分離試劑盒提取細胞中的線粒體，收集約2×107個細胞，冰浴預冷的PBS輕輕重懸細胞沉淀，取少量細胞計數(shù)，800×g，4℃離心5 min，棄上清。加入試劑A，離心10 s，冰上孵育1 min，加入試劑B，離心30 s，冰上孵育4 min，其中每隔1 min渦旋振蕩1次，加入試劑C，1 000× g，4℃離心5 min。沉淀為線粒體部分;將上清液于12 000×g、4℃離心5 min，為胞漿部分。

2.5免疫印跡法檢測相關蛋白表達MG-63細胞給藥培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌，提取細胞蛋白并定量。取適量裂解產物，以上樣量與緩沖液(1∶4)進行SDS-PAGE 1 h，轉移至硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入I抗孵育過夜，4℃，TBST洗滌;加入相應II抗室溫孵育1 h，TBST洗滌;顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。

3統(tǒng)計學處理

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1人參皂苷Rh2促進MG-63細胞的凋亡

空白對照組細胞的凋亡率為(2.79±0.37) %，加入人參皂苷Rh2后，其凋亡率顯著增加，凋亡率隨加入人參皂苷Rh2的濃度增大而增加，與空白對照組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，而空白對照組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義，見圖1，提示人參皂苷Rh2呈濃度依賴性促進了MG-63細胞的凋亡。

2 MTT法測定MG-63細胞存活率

結果顯示加入人參皂苷Rh2 48 h后，給藥組的吸光度顯著低于空白對照組，并隨人參皂苷Rh2濃度的增加而降低?？瞻讓φ战M與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學顯意義。人參皂苷Rh2作用隨濃度增加而降低MG-63細胞存活率，同時其作用具有濃度依賴性，32 μmol/L和64 μmol/L在各時點的存活率無顯著差異，因此選擇32 μmol/L進行后續(xù)實驗。

3 MG-63細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達水平

加入人參皂苷Rh2后，與空白對照組相比，MG-63細胞的Bax蛋白表達顯著增加(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著減少(P＜0.05)，從而導致Bcl-2/Bax比率顯著減少(P＜0.05) ;空白對照組和陰性對照組之間差異不顯著，見圖3。

4人參皂苷Rh2對Cyt C蛋白表達的影響

免疫印跡法結果顯示線粒體中Cyt C的含量較control組明顯降低，而胞漿中Cyt C的含量明顯升高(P＜0.05)，從而導致胞漿與線粒體中Cyt C的比值增加。提示人參皂苷Rh2能夠促進MG-63細胞中Cyt C從線粒體釋放進入胞漿，見圖4。

Figure 1.The effects of Rh2 on MG-63 cell apoptosis.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control.圖1流式細胞術檢測細胞凋亡

5人參皂苷Rh2對cleaved caspase-3蛋白水平的影響

給藥組中cleaved caspase-3的蛋白水平顯著高于空白對照組(P＜0.05)，而空白對照組和陰性對照組間差異不顯著，見圖5。

討論

細胞凋亡主要指機體除去損傷、老化細胞的重要機制，在機體的發(fā)育、生長、免疫等許多正常生理過程中起重要作用。線粒體屬于動態(tài)的細胞器，除了給機體各組織轉運能力外，其內部會依據(jù)各種不同生理條件作出相應的調整。細胞出現(xiàn)凋亡時，線粒體出現(xiàn)損傷，導致膜電位下降，通透性改變，使得線粒體中凋亡相關蛋白進入胞漿內。線粒體中Cyt C的釋放是caspase依賴性凋亡途徑中的關鍵步驟，繼而激活線粒體通路下游的caspase-9和caspase-3。Caspase-3是細胞凋亡的最終實施者，激活后可進入核內激活核酸內切酶，切割DNA，最終導致細胞凋亡。Bcl-2家族也是調控線粒體凋亡因子釋放的因素，其中Bcl-2抑制細胞凋亡，Bax促進細胞凋亡。在正常生理狀態(tài)下，促凋亡蛋白以非活性形式分布于細胞質和細胞骨架上，抗凋亡蛋白作為整合膜蛋白被隔離［7-8］。

Figure 2.The effects of Rh2 on the viability of MG-63 cells after treated for 48 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖2給藥48 h后，各組MG-63細胞的吸光度

Figure 3.The effects of Rh2 on the expression of Bcl-2 and Bax in the MG-63 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control.圖3人參皂苷Rh2對細胞中Bcl-2和Bax的蛋白表達的影響

Figure 4.The effects of Rh2 on the release of Cyt C in the MG-63 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control.圖4人參皂苷Rh2對Cyt C轉位的影響

Figure 5.The effects of Rh2 on the protein levels of cleaved caspase-3 in the MG-63 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control.圖5人參皂苷Rh2對激活型caspase-3蛋白水平的影響

本實驗探討了人參皂苷Rh2對人骨肉瘤細胞MG-63的作用效果。流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2可促進細胞凋亡，并且這種促進效果具有濃度依賴性。MTT法檢測結果可見，人參皂苷Rh2作用于細胞48 h后，隨著藥物濃度的增加，細胞存活率也逐漸降低。提示人參皂苷Rh2可促進骨肉瘤細胞的凋亡，與濃度呈正相關。當濃度為64 μmol/L時，細胞的存活率較32μmol/L時沒有顯著差異，可能是由于藥物在32 μmol/L時已接近藥物最大濃度，故后續(xù)實驗采用此濃度。此外，本實驗還應用免疫沉淀法檢測人參皂苷Rh2作用于細胞后線粒體途徑凋亡相關蛋白的表達。其中抗凋亡分子Bcl-2和促凋亡分子Bax決定了細胞生存或者凋亡的狀態(tài)，是細胞凋亡內源性線粒體通路的重要調節(jié)因子。實驗結果表明Bcl-2的表達減少同時Bax的表達增加，從而降低Bcl-2/Bax比值，使得線粒體膜電位降低，促使Cyt C從線粒體釋放進入胞漿中。此外，線粒體釋放Cyt C到胞漿中，caspase酶家族被切割而激活。本實驗中，我們采用Western blot法檢測到caspase-3的表達顯著增加。提示人參皂苷Rh2可能通過線粒體途徑促進骨肉瘤細胞的凋亡。Caspase酶家族主要存在于細胞質，能選擇性地切割某些蛋白質，使靶蛋白活化或失活［9］。Caspase-3主要負責切割細胞核內以及細胞質中的重要蛋白質，包括結構蛋白和調節(jié)蛋白。許多實驗表明，caspase大多在細胞凋亡中起主要作用，統(tǒng)稱caspase依賴性的細胞凋亡［10］，而在本實驗中，人參皂苷Rh2可能通過caspase依賴性凋亡途徑導致骨肉瘤細胞凋亡，但其更多機制需進行更多實驗進行確認。

近年來，中草藥來源的抗腫瘤藥日益?zhèn)涫荜P注，如紫杉醇、喜樹堿等［11-12］，已證明對惡性腫瘤有一定的治療效果，并已經(jīng)推廣到臨床使用。楊春肖等［13］發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2呈濃度依賴性抑制人卵巢癌細胞的增殖，且Rh2并未導致任何不良反應的發(fā)生，證實人參皂苷Rh2對腫瘤細胞具有生長抑制作用。而本實驗中同樣發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2呈濃度依賴性促進人骨肉瘤細胞的凋亡，通過線粒體途徑促進腫瘤細胞凋亡，為人參皂苷Rh2研制成新型抗腫瘤藥物提供實驗依據(jù)。

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(責任編輯:林白霜，羅森)

Effect of Ginsenoside Rh2 on apoptosis of human osteosarcoma cell line MG-63

WANG Li-min
(Department of Orthopedic，Victory Petroleum Administration Hospital，Dongying 257055，China.E-mail: wlingminmed@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of Ginsenoside Rh2 (Rh2) on the apoptosis of human osteosarcoma cell line MG-63.METHODS: The cell viability was determined by MTT assay.MG-63 cell apoptotic rate was examined by flow cytometry with Annexin V-PI double staining.The expression of Bcl-2，Bax，cytochrome C (Cyt C) and cleaved caspase-3 were measured by Western blot.RESULTS: Rh2 enhanced the apoptosis of MG-63 cells in a dose-dependent manner.Furthermore，after treatment with Rh2，the release of mitochondrial Cyt C and Bax expression were increased，while Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax were decreased as compared with control group (P＜0.05).The protein level of cleaved caspase-3 was also increased (P＜0.05).CONCLUSION: Ginsenoside Rh2 accelerates the apoptosis of MG-63 cells through mitochondria-dependent pathway，suggesting that Rh2 is a novel approach for the treatment of osteosarcoma.

［KEY WORDS］Ginsenoside Rh2; Human osteosarcoma cell line MG-63; Apoptosis

通訊作者△Tel: 0546-8811219; E-mail: wlingminmed@126.com

［收稿日期］2015-05-25［修回日期］2015-07-14

［文章編號］1000-4718(2015)09-1715-05

［中圖分類號］R730.23

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.033