周萍萍,李 偉,陸曉華,王國(guó)光,姜玉新△(皖南醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,病理生理學(xué)教研室,機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心,安徽蕪湖400)
硫化氫對(duì)糖尿病大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合的影響*
周萍萍1,李偉2,陸曉華3,王國(guó)光2,姜玉新1△
(皖南醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)教研室,2病理生理學(xué)教研室,3機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心,安徽蕪湖241002)
[摘要]目的:探討硫化氫對(duì)糖尿病大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合的影響。方法:將30只健康雄性SD大鼠,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NDC組)、糖尿病對(duì)照組(UDC組)和硫化氫處理組(TDA組),每組10只。腹腔注射鏈脲佐菌素(65 mg/kg)檸檬酸緩沖液(pH 4.5)建立糖尿病大鼠模型。1周后,將正常大鼠及糖尿病大鼠背部剪開(kāi)直徑為20 mm的圓形切口,正常組和糖尿病組大鼠的潰瘍創(chuàng)面以空白基質(zhì)處理,硫氫化處理組則用2%的硫氫化鈉涂抹潰瘍創(chuàng)面。分別在給藥后第5、10、15、20天測(cè)定傷口愈合率。21 d后處死大鼠,分別收集血漿以及肉芽組織,檢測(cè)血漿的凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)、凝血酶時(shí)間(thrombin time,TT)及纖維蛋白原(fibrinogen,F(xiàn)IB),白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù),ELISA檢測(cè)血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量,Western blot檢測(cè)肉芽組織中血紅素加氧酶1(HO-1)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)水平;肉芽組織進(jìn)行HE染色,光鏡觀(guān)察組織形態(tài)的變化。結(jié)果:與糖尿病組比較,硫氫化鈉處理明顯加快大鼠傷口愈合(P<0.01),提高了血清SOD活性(P<0.01),同時(shí)降低了MDA水平(P<0.01) ;血液學(xué)檢測(cè)顯示,硫氫化鈉明顯降低白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)量,延長(zhǎng)PT及TT,降低FIB水平。病理切片觀(guān)察顯示,糖尿病對(duì)照組大鼠肉芽組織有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),膠原纖維排列疏松且不規(guī)則,而硫化氫組大鼠肉芽組織中膠原排列整齊,血管生成增多(P<0.05)。此外,TDA組HO-1表達(dá)明顯高于UDC組,而TNF-α的水平則顯著低于UDC組。結(jié)論:硫化氫可促進(jìn)糖尿病大鼠傷口愈合,其機(jī)制可能與其提高抗炎及抗氧化作用、改善微循環(huán)進(jìn)而修復(fù)組織損傷有關(guān)。
[關(guān)鍵詞]硫化氫;糖尿病;傷口愈合
[修回日期]2015-07-28
潰瘍?yōu)樘悄虿〕R?jiàn)的血管并發(fā)癥,其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。研究認(rèn)為,高血糖引起的炎癥介質(zhì)釋放和氧化應(yīng)激導(dǎo)致末梢血管病變、神經(jīng)損害、微循環(huán)障礙、局部感染等是形成潰瘍和/或組織深度破壞的基礎(chǔ)[1],且傷口的修復(fù)愈合能力差,導(dǎo)致糖尿病足潰瘍數(shù)量迅速上升[2],截肢率居高不下,在日本可高達(dá)21.4%[3],我國(guó)糖尿病足潰瘍及截肢患者近年也呈增多趨勢(shì)。研究表明,通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的抗炎和抗氧化作用、改善微循環(huán)進(jìn)而修復(fù)組織損傷,最終可促進(jìn)糖尿病潰瘍面的愈合[4-5]。
硫化氫(H2S)為刺激性和窒息性的無(wú)色氣體,近年的研究表明,硫化氫在細(xì)胞活性中具有雙相調(diào)節(jié)作用,低濃度的硫化氫對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用,而較高濃度的硫化氫則表現(xiàn)為細(xì)胞毒作用[6]。由于硫化氫具有廣泛的生理學(xué)及病理生理學(xué)功能,因此,被認(rèn)為是繼NO和CO后的第3種氣體信號(hào)分子。硫化氫具有抗炎[7]、抗氧化[8]及促進(jìn)組織損傷修復(fù)的作用[9]。但其對(duì)糖尿病誘發(fā)的皮膚創(chuàng)面愈合的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在以硫氫化鈉作為硫化氫供體,探討硫化氫對(duì)糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合的影響。
1試劑
鏈脲佐菌素、硫氫化鈉購(gòu)自Sigma;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;大鼠來(lái)源的血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)和TNF-α鼠抗兔抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG II抗以及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
2動(dòng)物
健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只,體重(260 ±20) g。購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng),生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(蘇) 2014-0007。
3實(shí)驗(yàn)方法
3.1糖尿病模型的復(fù)制及分組大鼠自由進(jìn)食、飲水飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。隨機(jī)分為正常(non-diabetic control,NDC)組和糖尿病模型組。將糖尿病模型組禁食12 h,以腹腔注射鏈脲佐菌素65 mg/kg(溶于0.1 mol/L pH 4.5的無(wú)菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液),72 h后尾靜脈空腹采血測(cè)定血糖,血糖值>16.7 mmol/L的大鼠視為造模成功。隨機(jī)將糖尿病模型組大鼠分為糖尿病對(duì)照(untreated diabetic control,UDC)組和硫化氫處理(treated diabetic administration,TDA)組。
3.2潰瘍模型的制備及藥物處理糖尿病造模成功的大鼠飼養(yǎng)1周后,以10%水合氯醛0.3 mL/kg進(jìn)行麻醉,剔除背部毛發(fā),75%乙醇消毒,用手術(shù)剪于糖尿病大鼠背部剪切直徑為2 cm的圓形切口,切口深至筋膜。糖尿病對(duì)照組大鼠傷口以空白基質(zhì)處理,硫化氫處理組大鼠傷口以2%的硫氫化鈉處理,每日用藥1次,連續(xù)處理21 d。
3.3傷口愈合狀況測(cè)定給藥后,每天觀(guān)察大鼠傷口愈合及周?chē)装Y情況。并于給藥后的第5、10、15、20天測(cè)定潰瘍創(chuàng)面面積以分析創(chuàng)傷愈合率。各組大鼠于給藥21 d后處死,頸動(dòng)脈采血,分離血清,并取皮膚創(chuàng)面肉芽組織置于-80℃保存?zhèn)溆?,部分肉芽組織以10%中性甲醛固定,以備病理切片用。
3.4組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察肉芽組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,行HE染色,光鏡下觀(guān)察肉芽組織的形態(tài)學(xué)改變。
3.5SOD和MDA的測(cè)定離心分離血清,用試劑盒測(cè)定血清中SOD活性及MDA含量,操作按試劑盒檢測(cè)說(shuō)明進(jìn)行。
3.6白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)用Sysmex XE-2100自動(dòng)檢測(cè)儀測(cè)定白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù),樣本采集和檢測(cè)程序均按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
3.7凝血活性的測(cè)定采用STAGO的STA-Compact全自動(dòng)血凝儀進(jìn)行測(cè)定,試劑均采用STAGO原裝試劑,方法按儀器操作規(guī)程進(jìn)行。
3.8Western blot實(shí)驗(yàn)?。?0℃保存的各組皮膚肉芽組織,勻漿、離心后,標(biāo)定上清液蛋白濃度上樣,經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離后,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,按常規(guī)方法進(jìn)行脫脂奶粉封閉,TBST沖洗后加兔抗鼠HO-1和TNF-α I抗,4℃孵育過(guò)夜。TBST液沖洗,加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG II抗孵育,洗膜后DAB顯色。
4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,用SPSS 20.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,兩兩比較采用Bonferroni(方差齊)或Tamhane(方差不齊)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1硫化氫對(duì)創(chuàng)面愈合的影響
分別在給藥5、10、15和20 d檢測(cè)創(chuàng)面愈合率。結(jié)果表明:與NDC組相比,給藥5 d后UDC組的創(chuàng)面愈合率明顯下降(P<0.01),而TDA組創(chuàng)面愈合率未見(jiàn)明顯改善;在其它檢測(cè)時(shí)點(diǎn)中,UDC組的創(chuàng)面愈合率明顯下降(P<0.01) ;但與UDC組相比,TDA組的愈合率明顯升高(P<0.01) ;且NDC組和TDA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表1。這就說(shuō)明H2S可促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合。
表1 硫化氫對(duì)糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合率的影響Table 1.The effect of H2S on closure rate of wound (Mean±SD.n=10)
2血清SOD活性及MDA含量的變化
各組大鼠血清SOD活性及MDA含量的變化檢測(cè)結(jié)果顯示,與NDC組大鼠相比,UDC組大鼠血清的SOD活性明顯降低(P<0.01),而MDA的含量則顯著升高(P<0.01),提示糖尿病大鼠的抗自由基能力下降;而TDA組大鼠的SOD活性較UDC組有顯著提高(P<0.01),且MDA的含量顯著低于UDC組(P<0.01),表明經(jīng)H2S處理后,糖尿病大鼠的抗氧化能力明顯提高,見(jiàn)圖1。
Figure 1.The effect of H2S on the activity of SOD and the content of MDA in serum.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs NDC;##P<0.01 vs UDC.圖1硫化氫對(duì)糖尿病大鼠血清SOD活性及MDA含量的影響
3白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)
白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要因子,本研究對(duì)各組大鼠白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明,UDC組大鼠白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯高于NDC 組(P<0.01),而TDA組大鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù),白細(xì)胞水平低于UDC組(P<0.01),且淋巴細(xì)胞水平亦明顯低于UDC組大鼠(P<0.01),見(jiàn)表2。
表2 硫化氫對(duì)糖尿病大鼠血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的影響Table 2.The effect of H2S on the leukocytes and lymphocytes(Mean±SD.n=10)
4凝血活性的變化
凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)、凝血酶時(shí)間(thrombin time,TT)及纖維蛋白原(fibrinogen,F(xiàn)IB)可反映凝血活性變化。本研究通過(guò)檢測(cè)各組大鼠的PT、TT和FIB的結(jié)果顯示,與NDC組相比較,UDC組PT和TT均明顯縮短,而血漿FIB的含量明顯增加(P<0.01) ;經(jīng)H2S處理后,與UDC組相比,TDA組PT明顯改善,TT則顯著延長(zhǎng),并降低了FIB在血漿中的含量(P<0.01),見(jiàn)表3。這提示H2S可降低糖尿病大鼠的凝血活性。
表3 各組大鼠凝血活性的變化Table 3.The effect of H2S on the activities of coagulation (Mean ±SD.n=10)
5 HO-1和TNF-α的表達(dá)變化
Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與NDC組相比,UDC組大鼠皮膚肉芽組織HO-1的表達(dá)明顯降低,TDA組表達(dá)較UDC組明顯上調(diào);而UDC組大鼠TNF-α的表達(dá)明顯高于NDC組; TDA組NTF-α的表達(dá)明顯降低,見(jiàn)圖2。
Figure 2.The expression of TNF-α and HO-1 in the skin wound granulation tissues in rats.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs NDC;##P<0.01 vs UDC.圖2大鼠創(chuàng)面皮膚肉芽組織HO-1及TNF-α的表達(dá)
6傷口的形態(tài)學(xué)觀(guān)察
各組大鼠的傷口在創(chuàng)傷初期均有炎癥出現(xiàn)并伴有化膿; UDC組大鼠創(chuàng)面有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),膠原排列疏松且不規(guī)則,并有大量的滲出物;經(jīng)硫化氫處理后,TDA組大鼠的創(chuàng)面其膠原呈束狀排列且緊密而規(guī)則,見(jiàn)圖3。
Figure 3.Morphology observation of the wound from the rats (HE staining,×100).圖3大鼠創(chuàng)面形態(tài)結(jié)構(gòu)觀(guān)察
糖尿病潰瘍是糖尿病常見(jiàn)和嚴(yán)重的并發(fā)癥,主要是由于糖尿病患者血糖長(zhǎng)期控制不佳導(dǎo)致全身小動(dòng)脈、微小血管硬化,造成局部血供不良引起組織缺血缺氧甚至壞死,從而形成潰瘍。尤其外周血管病變所致潰瘍最為嚴(yán)重,其臨床主要表現(xiàn)為局部潰瘍和感染,且久治不愈易反復(fù)發(fā)作,嚴(yán)重者產(chǎn)生壞疽需截肢,常給患者帶來(lái)巨大的痛苦和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,改善糖尿病潰瘍創(chuàng)面的缺血缺氧及創(chuàng)面愈合過(guò)程極為關(guān)鍵。
硫化氫作為新的氣體信號(hào)分子,是機(jī)體內(nèi)許多生理功能活動(dòng)的重要中介,其生物學(xué)功能備受關(guān)注。研究表明硫化氫可能通過(guò)上調(diào)PPARγ表達(dá),通過(guò)PPARγ-NF-κB途徑減輕糖尿病心肌纖維化[10]。硫化氫既可作為神經(jīng)調(diào)質(zhì)和血管擴(kuò)張藥[11-12],也可作為炎癥和疼痛的內(nèi)生監(jiān)管調(diào)節(jié)子[7],同時(shí)還可加速潰瘍的愈合[13]。低濃度的硫化氫可通過(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移調(diào)控血管生成[14]。前期的研究顯示,硫化氫可改善組織因子誘發(fā)的家兔彌散性血管內(nèi)凝血模型的微循環(huán)及凝血活性的作用[15]。本研究結(jié)果表明,硫化氫處理后,糖尿病大鼠的PT和TT均顯著延長(zhǎng),且FIB降低,提示硫化氫改善了糖尿病大鼠的凝血時(shí)間。
炎癥反應(yīng)是創(chuàng)面愈合的始動(dòng)環(huán)節(jié),炎癥反應(yīng)細(xì)胞主要包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠創(chuàng)面早期出現(xiàn)紅腫、化膿等表現(xiàn),在傷口給藥5 d后,大鼠皮膚創(chuàng)面面積開(kāi)始減小,用藥10 d后,硫化氫處理組大鼠創(chuàng)面的愈合率明顯高于糖尿病對(duì)照組大鼠,至15 d時(shí)處理組大鼠傷口中心有新生上皮出現(xiàn),21 d時(shí),處理組大鼠創(chuàng)面基本愈合;且硫化氫處理提高了大鼠血清SOD水平,同時(shí)降低了MDA水平以及白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的數(shù)量;此外,肉芽組織中HO-1及TNF-α的表達(dá)升高提示硫化氫的抗炎癥及抗氧化作用明顯。病理切片顯示,硫化氫可促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面的膠原合成增加、排列整齊而緊密。
總之,本研究結(jié)果表明,硫化氫促進(jìn)糖尿病大鼠傷口愈合可能是通過(guò)提高抗炎、抗氧化作用以及凝血活性,最終加速膠原合成所致。但傷口愈合是一個(gè)極其復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,硫化氫促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面修復(fù)的詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
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(責(zé)任編輯:陳妙玲,羅森)
Effects of hydrogen sulfide on wound healing of skin ulcer in diabetic rats
ZHOU Ping-ping1,LI Wei2,LU Xiao-hua3,WANG Guo-guang2,JIANG Yu-xin1
(1Department of Physiology,2Department of Pathophysiology,3Experimental Center for Function Subjects,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China.E-mail: jiangyuxin2000@hotmail.com)
[ABSTRACT]AIM: To study the effect of hydrogen sulfide on wound healing of skin ulcer in diabetic rats.METHODS: Male SD rats were randomly divided into 3 groups,including non-diabetic control (NDC) group,untreated diabetic control (UDC) group,and treated diabetic administration (TDA) group.Diabetic rats were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ).After 1 week,wound healing model was prepared by making a round incision (2.0 cm in diameter) on the dorsal skin in full thickness.The rats from TDA group received 2% sodium bisulfide ointment on the skin ulcer wound,and the animals from UDC and NDC groups received control cream.After 21 d of treatment with sodium bisulfide,blood samples were collected for biochemical analysis,including prothrombin time (PT),thrombin time (TT),and fibrinogen (FIB) in plasma,as well as the activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) in the serum.White blood cells (WBC) and lymphocytes were also counted.Granulation tissues from the wound were processed for histological examination and Western blot analysis was used to detect heme oxygenase-1 (HO-1) and tumor necrosis factor α(TNF-α) expression.RESULTS: Compared with UDC group,sodium bisulfide treatment accelerated wound healing of skin ulcer (P<0.01),and increased the activity of SOD in serum (P<0.01) in the diabetic rats.The declined number of WBC and lymphocytes,prolonged PT and TT,and decreased FIB levels in rats treated with sodium bisulfied were also confirmed.Pathological section showed that there were inflammatory cell infiltration,and irregular and loose fibril alignment in the granulation tissue of rats from the UDC group,but there were regular fibril alignment and increased angiogenesis in the granulation tissue of rats from the TDA group (P<0.05).Furthermore,sodium bisulfide treatment raised HO-1 protein expression,and decreased TNF-α protein expression in the diabetic rats.CONCLUSION: Hydrogen sulfide accelerates the wound healing of skin ulcer in the rats with diabetes.The beneficial effect of H2S may be associated with formation of granulation,anti-inflammation,and antioxidation.
[KEY WORDS]Hydrogen sulfide; Diabetes; Wound healing
通訊作者△Tel: 0553-3932473; E-mail: jiangyuxin2000@hotmail.com
*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81172790) ;軍隊(duì)重點(diǎn)課題(No.BJN14C001)
[收稿日期]2015-04-20
[文章編號(hào)]1000-4718(2015)09-1657-05
[中圖分類(lèi)號(hào)]R363.1; R587.1
[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A
doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.023