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        過表達PI3K p55γ N末端氨基酸可抑制MGC803胃癌細胞的黏附性*

        2015-04-27 00:14:02郭紅艷齊曉丹張春晶孫曉杰齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室黑龍江齊齊哈爾161006
        中國病理生理雜志 2015年9期
        關(guān)鍵詞:激酶胃癌

        郭紅艷,齊曉丹,張春晶,吳 琦,孫曉杰(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,黑龍江齊齊哈爾161006 )

        過表達PI3K p55γ N末端氨基酸可抑制MGC803胃癌細胞的黏附性*

        郭紅艷,齊曉丹,張春晶,吳琦,孫曉杰△
        (齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,黑龍江齊齊哈爾161006 )

        [摘要]目的:研究磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) p55γ調(diào)節(jié)亞基N末端24個氨基酸(N24)過表達對胃癌細胞MGC803黏附性的影響,并初步探討其作用的分子機制。方法:通過脂質(zhì)體介導(dǎo)用pEGFP-N24和pEGFP-C1質(zhì)粒分別進行基因轉(zhuǎn)染,建立穩(wěn)定表達融合蛋白GFP-N24和GFP的MGC803細胞系。倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞的形態(tài)學(xué)變化,免疫印跡實驗鑒定轉(zhuǎn)染基因的蛋白表達,細胞黏附實驗檢測轉(zhuǎn)染細胞的黏附性,免疫印跡實驗檢測細胞黏附分子上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)和鈣緊張素(β-catenin)的表達,酶譜實驗檢測基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP9)和尿激酶型纖溶酶原活化因子(uPA)的表達。結(jié)果:建立了穩(wěn)定表達融合蛋白GFP-N24的MGC803/GFP-N24細胞系和表達GFP的MGC803/pEGFP-C1細胞系,但GFP-N24的表達量明顯低于GFP。基因轉(zhuǎn)染使MGC803細胞的形態(tài)由鋪路石樣轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞樣,胞漿分泌顆粒明顯增加。表達GFP-N24的MGC803細胞在纖黏連蛋白和膠原上的黏附性與對照組細胞相比明顯下降(P<0.05)。GFP-N24的表達使MGC803細胞黏附分子E-cadherin的表達增高,而Wnt信號通路關(guān)鍵分子β-catenin的表達降低,但不影響腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP9和uPA的表達與分泌。結(jié)論: PI3K p55γ N末端氨基酸過表達通過影響E-cadherin和β-catenin的表達而抑制胃癌MGC803細胞的黏附性。

        [關(guān)鍵詞]磷脂酰肌醇3-激酶;胃癌;細胞黏附; E-鈣黏蛋白

        [修回日期]2015-06-11

        磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)參與細胞內(nèi)多種信號通路,調(diào)節(jié)細胞的生長增殖,與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其調(diào)節(jié)亞基p55γ N末端結(jié)構(gòu)域不僅能與視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma,Rb)蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)細胞周期進程[1],還能與增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)相互作用促進DNA合成以及腫瘤發(fā)生[2]。p55γ N末端24個氨基酸(N24)過表達能明顯抑制胃癌、乳腺癌、大腸癌以及甲狀腺癌等多種細胞的生長、增殖、運動和遷移[2-6]。本文在此基礎(chǔ)上,研究p55γ N末端氨基酸過表達對胃癌細胞黏附性的影響,旨在探討其對胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響,為闡明p55γ在PI3K介導(dǎo)的人類腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ),同時也為靶向PI3K p55γ調(diào)節(jié)亞基的藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。

        材料和方法

        1質(zhì)粒與細胞株

        重組質(zhì)粒pEGFP-N24含有PI3Kp55γ調(diào)節(jié)亞基N末端24個氨基酸cDNA,以EcoR I位點和BamH I位點插入綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-C1而成,由美國霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院夏獻民博士惠贈。人胃低分化黏液腺癌細胞株MGC803由本室凍存,細胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),用0.25%胰酶消化傳代。

        2主要試劑

        質(zhì)粒提取試劑盒(Promema) ; EcoR I、BamH I以及DL10000 DNA Marker(TaKaRa) ; GFP單克隆抗體(Clotech) ;鈣緊張素(β-catenin)單克隆抗體(Transduction Laboratories) ;上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗體(Zymed) ; Lipofectamine、G418和RPMI-1640(Gibco) ;纖黏連蛋白(fibronectin,F(xiàn)N)、鼠尾膠原(collagen)、α-酪蛋白(α-casein)、明膠(gelatin)、纖溶酶原(plasminogen)、β-actin單克隆抗體和SDS-PAGE材料(Sigma) ;新生小牛血清(Hy-Clone) ;中低分子量蛋白標準、DEL2000 DNA Marker和結(jié)晶紫(鼎國生物公司) ;細胞培養(yǎng)瓶和96孔培養(yǎng)板(Costar) ; HRP-IgG和ECL發(fā)光試劑盒(Santa Cruz) ; X-OmatTM診斷用X光片(Kodak) ;酶標儀和垂直板電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)MINI型(Bio-Rad) ;紫外/可見分光光度計(JENWAY)。

        3主要方法

        3.1重組質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-N24以及空載體質(zhì)粒pEGFP-C1通過質(zhì)粒提取試劑盒從大腸桿菌DH5α中分離純化,質(zhì)粒DNA的濃度和純度通過紫外分光光度計測定,重組質(zhì)粒pEGFP-N24通過EcoR I和BamH I雙酶切后進行2.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

        3.2基因轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立采用Lipofectamine進行細胞轉(zhuǎn)染,具體操作按說明書進行。生長良好的MGC803細胞分2組,于轉(zhuǎn)染前1 d接種到6孔板中,待細胞總面積達到60%~80%,取3~5 μg pEGFP-N24質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒pEGFP-C1分別進行基因轉(zhuǎn)染,48 h后用含600 mg/L G418的RPMI-1640培養(yǎng)液篩選抗性克隆,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系,分別將其命名為MGC803/GFP-N24和MGC803/pEGFP-C1,通過免疫印跡方法對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中的蛋白表達進行鑒定,細胞擴大培養(yǎng)后用于實驗。

        3.3細胞形態(tài)學(xué)觀察將MGC803/GFP-N24、MGC803/pEGFP-C1以及親本細胞MGC803分別用0.25%胰酶消化后,按每孔5×105接種于6孔培養(yǎng)板中,24~48 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

        3.4細胞黏附實驗分別用牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA; 2 g/L)、FN(25 mg/L)和collagen (30 mg/L)包被96孔培養(yǎng)板,37℃溫育2 h后4℃過夜備用。常規(guī)培養(yǎng)細胞,在包被不同基質(zhì)的孔中分別接種MGC803、MGC803/pEGFP-C1以及MGC803/GFP-N24細胞(2×104/well),每種基質(zhì)不同的細胞各設(shè)4個復(fù)孔。37℃、5% CO2培養(yǎng)3~4 h后,用0.9%生理鹽水洗去未黏附的細胞。黏附細胞經(jīng)甲醇固定15 min,0.4%結(jié)晶紫染色10 min,PBS漂洗3次,1% SDS于37℃溶解1 h。酶標儀上測定波長595 nm吸光度值作為細胞黏附的指標。每組結(jié)果取4個復(fù)孔的均值,實驗在不同時間重復(fù)3次。

        3.5免疫印跡實驗分別提取MGC803、MGC803/pEGFP-C1以及MGC803/GFP-N24細胞總蛋白,采用Bradford法進行蛋白定量后進行SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜。將硝酸纖維素膜放入封閉液中,室溫封閉2 h;按1∶500~1∶1 000稀釋I抗GFP、β-actin、E-cadherin和β-catenin,4℃過夜; TBST漂洗3次,每次10 min;再按1∶1 000稀釋II抗,室溫孵育1 h;用TBST室溫漂洗后進行ECL顯色。使用Bio-Rad公司的GEL Doc 2000數(shù)字成像系統(tǒng)及其圖像分析軟件Multi-AnalystR/PC對Western blot雜交帶進行密度掃描分析。上述實驗均在不同時間重復(fù)3次。

        3.6酶譜實驗在6孔培養(yǎng)板中按照每孔5×105個細胞分別接種MGC803、MGC803/pEGFP-C1以及MGC803/GFP-N24細胞,無血清培養(yǎng)48 h后收集上清,進行SDS-PAGE。但在分離膠的配制中,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)酶譜實驗需加1%明膠使之終濃度為0.1%,行10%非還原性SDS-PAGE; uPA酶譜實驗加1 g/L酪蛋白和20 mg/L纖溶酶原,行8%非還原性SDS-PAGE。樣品不經(jīng)加熱變性,與非還原性上樣緩沖液混合上樣直接進行電泳。電泳結(jié)束后,取下膠用蒸餾水漂洗,2.5% Triton X-100中室溫輕搖2 h。蒸餾水漂洗后,分別放入明膠酶緩沖液(MMP9酶譜)和甘氨酸緩沖液中(uPA酶譜),于37℃搖床緩慢搖動5~12 h,0.25%考馬斯亮藍R250染色4 h,脫色液中脫色,直至出現(xiàn)負染帶。實驗在不同時間重復(fù)3次。

        4統(tǒng)計學(xué)處理

        應(yīng)用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,2組均數(shù)的比較采用雙側(cè)t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié)果

        1重組質(zhì)粒pEGFPN24的分離與鑒定

        重組質(zhì)粒擴增后用EcoR I和BamH I進行酶切鑒定。pEGFP-N24質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后,在2.5%瓊脂糖電泳圖中下方可見一清晰的DNA帶,此即為長度72 bp的N24p55γ,見圖1。重組質(zhì)粒pEGFP-N24轉(zhuǎn)染到真核細胞中即能表達融合蛋白GFP-N24,而空載體pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細胞后表達GFP。

        2轉(zhuǎn)染細胞的形態(tài)學(xué)變化

        光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)親本細胞MGC803為梭形或圓形,呈“鋪路石”狀生長,但基因轉(zhuǎn)染后細胞的形態(tài)向扁平狀長梭形變化,尤其是表達GFP-N24的MGC803細胞,其形狀由“鋪路石”形轉(zhuǎn)變?yōu)椤俺衫w維細胞”形,同時在轉(zhuǎn)染細胞的胞漿內(nèi)可見大量分泌顆粒,見圖2。免疫印跡結(jié)果顯示,在親本細胞裂解液中未檢測到蛋白帶,而在2組轉(zhuǎn)染細胞的裂解液中均檢測到特異性蛋白帶,表明轉(zhuǎn)染基因在MGC803細胞中能夠有效表達。但融合蛋白GFP-N24的表達量明顯低于空載體中GFP的表達量(P<0.05),見圖3。

        Figure 1.Electrophoretic restriction endonuclease identification of pEGFP-N24.1: pEGFP-N24 cut by EcoR I and BamH I; 2: pEGFP-N24 cut by EcoR I; 3: pEGFP-C1 vector.圖1 pEGFP-N24重組質(zhì)粒的酶切鑒定

        Figure 2.The effect of N24p55γ on the morphology of MGC803 cells (×200).圖2 N24p55γ轉(zhuǎn)染對MGC803細胞形態(tài)的影響

        3 GFP-N24過表達對MGC803細胞黏附性的影響

        細胞黏附實驗結(jié)果顯示,各組細胞在1% BSA上的黏附性沒有差別。但MGC803/GFP-N24組細胞在膠原和纖黏連蛋白上的黏附性明顯降低,與親本細胞和空載體細胞相比,差異均顯著(P<0.05),見表1。

        4 GFP-N24過表達對E-cadherin和β-catenin表達的影響

        為了研究基因轉(zhuǎn)染對細胞黏附性影響的作用機制,通過免疫印跡方法檢測了細胞黏附分子E-cadherin和Wnt信號通路關(guān)鍵分子β-catenin的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與親本細胞及轉(zhuǎn)染空載體的細胞相比,GFP-N24的表達使MGC803細胞內(nèi)源性E-cadherin的表達增高、而β-catenin的表達降低(P<0.05)。在E-cadherin及β-catenin的表達上,親本細胞和空載體細胞組相比,差異不顯著。見圖4。

        5 GFP-N24過表達對MMP9和尿激酶型纖溶酶原活化因子(urokinase-type plasminogen activator,uPA)表達和分泌的影響

        由于MMP和uPA與細胞的遷移、黏附和轉(zhuǎn)移相關(guān),通過酶譜實驗檢測MMP9和uPA的表達。結(jié)果在各組細胞的上清液中均檢測到分子量82 kD的MMP9和分子量55 kD的uPA的表達,但在MMP9 和uPA的表達量上各組細胞之間均無明顯差異,見圖5。

        Figure 3.The expression of GFP-N24 fusion protein detected by Western blot in MGC803 transfected cells.Mean± SD.n=3.#P<0.05 vs MGC803/pEGFP-C1.圖3免疫印跡方法檢測轉(zhuǎn)染細胞中融合蛋白GFP-N24的表達

        Figure 4.The effects of N24p55γ plasmid transfection on the expression of E-cadherin and β-catenin.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs MGC803;#P<0.05 vs MGC803/pEGFP-C1.圖4 N24p55γ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對E-cadherin和β-catenin表達的影響

        表1 細胞黏附實驗檢測各組細胞的黏附性Table 1.Adhesion of the cells with different treatments was determined by cell adhesion assay (A595.Mean±SD.n=4)

        Figure 5.The expression and secretion of MMP9 and uPA were detected by zymography after N24p55γ plasmid transfection.圖5酶譜法檢測N24p55γ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對MMP9和uPA表達的影響

        討論

        國家癌癥中心和衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局2013年公布,在我國惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率中,胃癌分別位居第2和第3位。世界衛(wèi)生組織在《全球癌癥報告2014》中亦指出,中國胃癌發(fā)病率領(lǐng)先世界。PI3K信號通路的持續(xù)激活與胃癌的發(fā)生密切相關(guān),p55γ作為PI3K的調(diào)節(jié)亞基,其不僅可以通過調(diào)控催化亞基的活性、影響催化亞基的亞細胞定位調(diào)節(jié)PI3K的活性,而且還可以繞過經(jīng)典的PI3K/Akt信號通路發(fā)揮其獨特的細胞生物學(xué)功能[7]。在結(jié)直腸癌中,p55γ經(jīng)由NF-κB信號通路上調(diào)乏氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的表達,抑制血管生成因子VEGF的表達,從而促進結(jié)直腸癌的血管生成[8];而在白血病細胞HL60和K562中,p55γ N末端24個氨基酸通過Toll受體途徑調(diào)控CD11b及CD14的表達,并與全反式維甲酸共同作用抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞分化[9]。

        本研究建立了穩(wěn)定表達N24p55γ的胃癌細胞系,發(fā)現(xiàn)該細胞在形態(tài)上由鋪路石形轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞形,且胞漿內(nèi)可見大量分泌顆粒。由于N24p55γ能夠使細胞周期G1/S期延長、細胞周期蛋白cyclin D1表達減少,因此導(dǎo)致了實驗中雖檢測到融合蛋白GFP-N24的表達,但其表達量卻明顯低于對照組中GFP的表達量。前期研究發(fā)現(xiàn),N24p55γ抑制胃癌細胞的運動和遷移[4],由于細胞的遷移和黏附是相互協(xié)調(diào)的,腫瘤細胞間黏附能力下降導(dǎo)致腫瘤細胞從原發(fā)瘤脫落游離,而腫瘤細胞與脈管內(nèi)皮細胞或細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)間的黏附增強又是腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。本研究N24p55γ過表達使MGC803細胞在纖黏連蛋白和膠原上的黏附性均降低。推測融合蛋白GFP-N24會抑制細胞與基質(zhì)間的黏附,這將導(dǎo)致細胞通過ECM侵襲轉(zhuǎn)移能力的下降。細胞黏附分子E-cadherin的減少會導(dǎo)致腫瘤細胞之間的黏附力降低,腫瘤細胞容易脫落而出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,因此E-cadherin的高表達被看作是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的因素,本研究發(fā)現(xiàn)GFP-N24的表達使MGC803細胞E-cadherin的表達明顯增高,這將導(dǎo)致腫瘤細胞與細胞之間的黏附性增加,而其同時又導(dǎo)致Wnt信號通路關(guān)鍵分子β-catenin表達的減少,其結(jié)果是Wnt/β-catenin信號通路被抑制,二者共同作用最終將抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛能。

        MMP是細胞外基質(zhì)重建或降解、去除細胞遷移屏障的關(guān)鍵酶,腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的潛能與其產(chǎn)生MMP的能力正相關(guān)。uPA能裂解細胞外基質(zhì),刺激纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白溶酶,后者直接介導(dǎo)通過降解膠原、纖黏連蛋白、LN或間接激活MMP2、MMP3、MMP9所導(dǎo)致的侵襲。MMP與uPA在腫瘤細胞ECM降解中的作用相輔相成,uPA表達上調(diào)是MAPK和PI3K影響細胞形態(tài)、黏附遷移作用的主要聚集點。PI3K的催化亞基p110δ突變失活能夠上調(diào)MMP3和MMP9的表達而引起血管損傷[10];我們前期研究發(fā)現(xiàn),PI3K的調(diào)節(jié)亞基p55γ N末端過表達影響乳腺癌MDA-MB-231細胞MMP9的表達和分泌,但本研究中其對胃癌MGC803細胞MMP9和uPA的表達與分泌卻未見影響,具體原因和機制尚需更深入的研究。

        最新研究發(fā)現(xiàn),N24p55γ在人角質(zhì)細胞HaCaT中過表達能通過TLRs/MyD88信號通路影響TNF-α、IL-6和IL-8等細胞因子的釋放,參與機體細胞的免疫調(diào)節(jié)[11]。作為PI3K的調(diào)節(jié)亞基,目前對p55γ的細胞生物學(xué)功能仍未完全闡明,但越來越多的證據(jù)顯示其參與細胞生長增殖、遷移黏附以及免疫內(nèi)分泌等方面的調(diào)控。由于PI3K介導(dǎo)的信號通路在不同的抗癌療法如化學(xué)治療、內(nèi)分泌治療、RTK抑制劑治療、靶向MAPK治療以及免疫治療等多方面起著至關(guān)重要的作用[12],而本文又證實其p55γ調(diào)節(jié)亞基N末端氨基酸在胃癌細胞中過表達能夠抑制胃癌細胞的黏附性,雖然其作用的分子機制尚未闡明,但N24p55γ在胃癌的治療上仍具有潛在的應(yīng)用前景。

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        (責(zé)任編輯:陳妙玲,余小慧)

        Overexpression of N-terminal amino acids of p55γ regulatory subunit of PI3K inhibits cell adhesion of human gastric carcinoma MGC803 cells

        GUO Hong-yan,QI Xiao-dan,ZHANG Chun-jing,WU Qi,SUN Xiao-jie
        (Department of Biochemistry,Qiqihar Medical College,Qiqihar 161006,China.E-mail: sunxj97@gmail.com)

        [ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of the N-terminal 24-amino acid (N24) overexpression in p55γ regulatory subunit of phosphatidylinositiol 3-kinase (PI3K) on the cell adhesion of human gastric carcinoma cell MGC803.METHODS: MGC803 cells,which stably expressed GFP-N24 fusion protein and GFP alone,were generated by transfection with pEGFPN-24 plasmid and control plasmid pEGFP-C1,respectively.The morphological change of the cells was observed under inverted microscope.The expression of GFP-N24 fusion protein was detected by Western blot.The adhesion of the cells was determined by cell adhesion assay.The effects of GFP-N24 fusion protein on the expression of E-cadherin and β-catenin were analyzed by Western blot.The expression and secretion of matrix metalloproteinase 9 (MMP9) and urokinase-type plasminogen activator (uPA) in the MGC803 cells were detected by gelatin zymography.RESULTS: MGC803/GFP-N24 cell line steadily expressed GFP-N24 fusion protein and MGC803/GFP cell line steadily expressing GFP were successfully established,but the expression of fusion protein GFP-N24 was lower than that of the control protein GFP.The morphological changes of the transfected cells from paving stone to fibroblast cell form after gene transfection,and the cytoplasm secretory granules were increased significantly.The cell adhesion to fibronectin and collagen decreased after GFP-N24 transfection.GFP-N24 fusion protein increased the expression of cell adhesion molecule E-cadherin and decreased the wnt signal pathway molecule β-catenin in the MGC803 cells.However,it did not affect the expression and secretion of tumor metastasis-related proteins MMP9 and uPA.CONCLUSION: Overexpression of N24p55γ inhibits cell adhesion by influencing the expression of E-cadherin and β-catenin in the MGC803 cells.

        [KEY WORDS]Phosphatidylinositol 3-kinase; Gastric carcinoma; Cell adhesion; E-cadherin

        通訊作者△Tel: 0452-2663151; E-mail: sunxj97@gmail.com

        *[基金項目]黑龍江省青年科學(xué)基金資助項目(No.QC2014C035)

        [收稿日期]2015-04-07

        [文章編號]1000-4718(2015)09-1563-05

        [中圖分類號]R730.23; R735.2

        [文獻標志碼]A

        doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.005

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