冀樹伸，朱伯強(qiáng)，符林春(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州 510405)

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雞樹條莢蒾生長(zhǎng)期不同部位綠原酸含量變化分析

冀樹伸，朱伯強(qiáng)，符林春*
(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州 510405)

目的：采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定雞樹條莢蒾生長(zhǎng)期不同部位綠原酸含量，為其資源合理利用提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用VP-ODS C18(4.6mm×150mm，5μm)色譜柱，以乙腈∶0.4%磷酸(17∶83)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為327nm。果實(shí)和葉片的綠原酸提取液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣, 進(jìn)樣量為20μL。結(jié)果：綠原酸濃度在0.01～54.0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 7)。8月果實(shí)中綠原酸含量最高，為49.35μg/mL。結(jié)論：雞樹條莢蒾生長(zhǎng)期果實(shí)中綠原酸含量變化顯著，且8月份積累最多。

雞樹條莢蒾；綠原酸；高效液相色譜法；含量測(cè)定

雞樹條莢蒾(ViburnumsargentiiKoehne)系忍冬科莢蒾屬植物，又名天目瓊花，民間作“雞樹條”藥用[1]。為落葉灌木，分布于遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古、山東、河北、四川、浙江等地，朝鮮、日本、前蘇聯(lián)也有分布，其天然資源極為豐富[2-3]。雞樹條莢蒾所含的有效成分綠原酸具有廣譜抗病毒、抗菌、抗炎等藥理作用[4]，對(duì)消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)均有療效，同時(shí)又是很多中藥現(xiàn)代制劑如雙黃連注射液、雙花注射液的原料[5]。本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定雞樹條莢蒾生長(zhǎng)期不同部位綠原酸含量，并分析了不同時(shí)期不同部位綠原酸含量的變化，以期為合理利用藥用植物資源提供依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

本試驗(yàn)選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的雞樹條莢蒾植株，在其展葉期以及果實(shí)轉(zhuǎn)色期，采摘大小一致、方向相同、長(zhǎng)勢(shì)相近的葉片與果實(shí)，放陰涼處陰干至恒重，用粉碎機(jī)粉碎，備用，采樣時(shí)間為7月5日、7月15日、7月25日、8月5日、8月15日。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀(島津LC-20AT)，電子分析天平(梅特勒)，KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，中藥粉碎機(jī)(溫州LG-08A)，水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠HH-S4)，SHB111循環(huán)水式多用真空泵，高速冷凍離心機(jī)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(步琪)。

綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào) 110753-200212)、95%乙醇(分析純)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、磷酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、石油醚(分析純)。

1.3 綠原酸的提取

將干燥的雞樹條莢蒾果實(shí)用研缽研碎，稱取4.0g，用石油醚脫脂，之后加乙酸乙酯40mL，超聲提取30min,提取2次，控制溫度在35 ℃左右。過(guò)濾，合并濾液，定容于80mL。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾，用色譜甲醇定容于5mL。將提取溶液用0.22μm濾膜過(guò)濾，取20μL上樣。將干燥的雞樹條莢蒾葉用研缽研碎，稱取10.0g，用石油醚脫脂，之后加乙酸乙酯100mL，超聲波提取30min，提取2次，控制溫度在35℃左右。過(guò)濾，合并濾液，定容于200mL。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾，用色譜甲醇定容于5mL。將提取溶液用0.22μm濾膜過(guò)濾，取20μL上樣[6-13]。

1.4 色譜條件

色譜柱：VP-ODS C18柱(4.6mm×150mm)；流動(dòng)相：乙腈∶0.4%磷酸(17∶83)；流速：1mL·min-1；0.45μm濾膜

抽濾，等梯度洗脫，進(jìn)樣量：20μL；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：327nm；靈敏度0.5AUFS[6]。

1.5 精密度試驗(yàn)

在上述色譜條件下，精密吸取1.00mg·L-1對(duì)照品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，求得對(duì)應(yīng)的綠原酸含量，得RSD為1.90%，說(shuō)明綠原酸較為穩(wěn)定。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一時(shí)期果實(shí)中綠原酸提取液共5份，進(jìn)樣測(cè)定。求得對(duì)應(yīng)的綠原酸含量，計(jì)算其含量的RSD值為1.16%，說(shuō)明綠原酸在樣品中較為穩(wěn)定。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品4.6mg溶于甲醇中，定容至50mL容量瓶中，配制成0.092mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中吸取3、5、7、9、11mL用甲醇稀釋至25mL容量瓶中，用0.22μm濾膜過(guò)濾，取10μL上樣。以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線[6-13]。

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.8 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜

用高效液相色譜法，在規(guī)定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)量，用標(biāo)準(zhǔn)品溶液確定綠原酸色譜峰的保留時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜見圖1，綠原酸標(biāo)品的保留時(shí)間為4.190min。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜

2.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

濃度為54.000μg/mL、27.000μg/mL、13.500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液用高效液相色譜法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y= 416 74.06X-0.012, 相關(guān)系數(shù)r=0.999 701 0，說(shuō)明綠原酸濃度在0.01～54.000μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

2.3 樣品中綠原酸含量的測(cè)定

測(cè)得7月5日、7月15日、7月25日、8月5日、8月15日雞樹條莢蒾果實(shí)和葉片中綠原酸的峰面積與其相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度見表1。由t檢驗(yàn)得知，t=5.004>t0.01(4)，則P<0.01，即果實(shí)與葉片的綠原酸含量有極顯著差異，雞樹條莢蒾果實(shí)中綠原酸的含量明顯高于葉片中綠原酸的含量。

表1 雞樹條莢蒾生長(zhǎng)期的果實(shí)和葉片中綠原酸含量變化

2.4 生長(zhǎng)期綠原酸含量變化分析

測(cè)得7月5日、7月15日、7月25日、8月5日、8月15日雞樹條莢蒾果實(shí)和葉片中綠原酸質(zhì)量濃度后，分析比較雞樹條莢蒾不同時(shí)期果實(shí)和葉片中綠原酸含量變化，見圖3。

圖3 生長(zhǎng)期雞樹條莢蒾中綠原酸含量變化

3 討論

從圖3可以看出，生長(zhǎng)期雞樹條莢蒾果實(shí)中綠原酸含量呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降再增長(zhǎng)再下降的趨勢(shì)。從7月5日至7月15日較快增長(zhǎng)，含量接近最高，為48.122μg/mL；7月15日至7月25日緩慢下降；7月25日至8月5日又緩慢增長(zhǎng)，含量達(dá)到最高，為49.352μg/mL；8月5日至8月15日又較快下降。生長(zhǎng)期雞樹條莢蒾葉中片綠原酸含量都較

低，變化趨勢(shì)不明顯。

從生長(zhǎng)期雞樹條莢蒾中綠原酸含量變化來(lái)看，果實(shí)中綠原酸含量在7月15日較高，為48.12288μg/mL，在8月5日達(dá)到最高，為49.35275μg/mL。葉片中綠原酸含量在7月15日達(dá)到最高，為0.3543μg/mL。果實(shí)中綠原酸含量與葉片中有極顯著差異，果實(shí)>葉片，而且生長(zhǎng)期果實(shí)中綠原酸含量變化比較顯著。因此8月為最佳采收時(shí)期，能充分利用雞樹條莢蒾果實(shí)中積累的綠原酸。

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

The Content Change Analysis of Chlorogenic Acid in Different Part ofViburnumsargentiiDuring the Different Growing Time

Ji Shushen, Zhu Boqiang, Fu linchun*
(Tropical Medicine Institute, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China)

Objective:To determine the content of chlorogenic acid in different part ofViburnumsargentiiduring the different growing time by high-performance liquid chromatography (HPLC) and provide a scientific basis for reasonable utilization of the herb.Methods:All samples were determined by VP-ODS C18column (150mm×4.6mm, 5μm) at UV 327 nm wavelength, using acetonitrile-0.4% phosphoric acid as the mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min. The determination of extracting solution from the fruit and leaves of the herb was carried out by direct injection after 0.22μm micropore filter and the injection sample size was 20μL.Results:The calibration curve was linear within the range of 0.01～54.0 μg/mL (r=0.999 7)。In August, the content of chlorogenic acid from the fruit of Viburnum sargentii was 49.35ug/mL and reached the highest concentrations.Conclusion:The content of chlorogenic acid from the fruit ofViburnumsargentiivaried significantly during the different growing time and reached the highest concentrations in August.

ViburnumsargentiiKoehne; Chlorogenic Acid；HPLC; Determination of Content

2015-01-15

冀樹伸(1988-),男, 廣州中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治病毒性疾病。

符林春(1957-)，男，廣州中醫(yī)藥大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治病毒性疾病。

R284.2

A

1673-2197(2015)11-0034-03

10.11954/ytctyy.201511014