盧秀梅，李 巖，李 翎，吳萬(wàn)垠

(1.香港巖龍中醫(yī)藥有限公司，中國(guó) 香港；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)中心，廣東 廣州 510405;3 廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

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巖龍膠囊對(duì)Lewis肺癌小鼠Bcl-2、Caspase-3及CyclinD1表達(dá)的影響

盧秀梅1，李 巖1，李 翎2，吳萬(wàn)垠3

(1.香港巖龍中醫(yī)藥有限公司，中國(guó) 香港；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)中心，廣東 廣州 510405;3 廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

目的：研究巖龍膠囊對(duì)Lewis 肺癌荷瘤小鼠瘤細(xì)胞的Bcl-2、Caspase-3及CyclinD1的表達(dá)，探索其抑瘤機(jī)制。方法：將40只Lewis 肺癌瘤株轉(zhuǎn)染成功的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為四組: 巖龍膠囊高劑量組、巖龍膠囊低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組各10只。造模第4天，巖龍膠囊兩組均灌胃中藥，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射順鉑注射液，陰性對(duì)照組用等體積生理鹽水灌胃，均每天1次，共給藥10天,并記錄小鼠一般情況，造模第14天處死小鼠，測(cè)取各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果：與陰性對(duì)照組比較，巖龍膠囊高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的瘤重明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.001)。巖龍膠囊高、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的抑瘤率分別為19.41%、8.68%、39.34%。與陰性對(duì)照組比較，巖龍膠囊高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.001)。巖龍膠囊高、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的肺轉(zhuǎn)移抑制率分別為40%、32.4%、53.3%。與陰性對(duì)照組比較，巖龍膠囊高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組能明顯降低Bcl-2和CyclinD1的表達(dá)，并能提高Caspase-3的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.001，P<0.05)。結(jié)論：巖龍膠囊對(duì)Lewis肺癌小鼠有一定的抑瘤和抗轉(zhuǎn)移作用,機(jī)制可能與降低Bcl-2和CyclinD1的表達(dá)，提高Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

巖龍膠囊； Lewis 肺癌；Bcl-2；Caspase-3；CyclinD1;表達(dá)

巖龍膠囊是中醫(yī)腫瘤專(zhuān)家李巖教授所研制,其配方用于惡性腫瘤臨床與實(shí)驗(yàn)研究有20余年，適用于多種常見(jiàn)惡性腫瘤。該方由蛇莓、龍葵等復(fù)方中藥組成，功能以清熱解毒化瘀為主，扶正為輔。既往Ⅰ期實(shí)驗(yàn)證實(shí)巖龍膠囊對(duì)Lewis肺癌瘤株轉(zhuǎn)染的C57BL/ 6 小鼠有抑瘤和抗肺轉(zhuǎn)移作用[1],并能提高小鼠的CD4表達(dá)和降低CD44V6表達(dá)[2]。本次Ⅱ期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究巖龍膠囊對(duì)這類(lèi)小鼠的Bcl-2、Caspase-3及CyclinD1表達(dá)的影響，探討其抑瘤和抗轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002。小鼠和SPF級(jí)鼠飼料購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

動(dòng)物房室溫20～25℃，濕度40%～70%，實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施許可證號(hào)：SYXK(粵)2008-0092。

1.3 藥物

1.3.1 受試藥物 巖龍膠囊由廣東巖龍腫瘤防治研究所提供，批號(hào)：120208。臨床用量：2.7g/天(3次/天，3粒/次，0.3g/粒),小鼠等效劑量：0.55g/kg。給藥劑量：巖龍膠囊高劑量：等效劑量8倍, 即4.4g/kg；巖龍膠囊低劑量：等效劑量4倍, 即2.2g/kg。給藥劑量及方法：0.5mL灌胃給藥，每日1次。

1.3.2 陽(yáng)性對(duì)照藥 順鉑注射液(DDP)，南京制藥廠有限公司，批號(hào)：20110401，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20030675。順鉑注射液為療效可靠、抗瘤譜廣的藥物，適用于小細(xì)胞與非小細(xì)胞肺癌、睪丸癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、肉瘤、頭頸部腫瘤及各種鱗狀上皮癌和惡性淋巴瘤等的治療。給藥劑量及方法： 0.001g/kg，腹腔注射。

1.3.3 陰性對(duì)照 生理鹽水，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：T1206011。劑量及方法：0.5mL灌胃，每日1次。

1.4 試劑與儀器

流式細(xì)胞試劑Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb (PE Conujgate)(Cell Signaling Technology，批號(hào)：1212012)；BCL-2(C-2)PE(Santa Cruz Biotechnology，批號(hào)：G3009)；RbmAb to Cyclin D1 (SP4) (FITC) (abcam , 批號(hào)：GR84529-1)；Goat Anti-Rabbit IgG-PE(二抗)，(Santa Cruz Blotechnology，批號(hào)：B1412)；TritonX-100 (華美生物工程公司 ，批號(hào)BR2681)；甲醛 (廣州市中南化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：310609)；冰醋酸 (天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20100818)；苦味酸 (廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20081201-1)；無(wú)水乙醇(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120206)；AE200型電子分析天平(Mettler)；微量移液器(日本NICHIRYO)；T25B型組織分散機(jī)(馬來(lái)西亞JKIKA WORKS)；TDL-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN COULTE公司 ALTRA型，四色熒光，配套EXPO 32 采集分析軟件)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物造模[3]使用已冷存的Lewis肺癌細(xì)胞，按每只小鼠0.2mL(約含活細(xì)胞 1 × 107個(gè))接種于6～8周齡的C57BL/6小鼠背側(cè)皮下。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將有腫瘤生長(zhǎng)的小鼠隨機(jī)分組：巖龍膠囊高、低劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組，陰性對(duì)照組。每組10只。造模第4天，開(kāi)始灌胃給藥，每天1次，共給藥10天。用藥后觀察小鼠一般情況。造模第14天，處死小鼠，測(cè)瘤重，計(jì)算抑瘤率；切取瘤體組織測(cè)Bcl-2、Caspase-3、CyclinD1，計(jì)數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。

抑瘤率(%)=(對(duì)照組瘤重平均值-用藥組瘤重平均值)/對(duì)照組瘤重平均值×100%

肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)觀察方法：將肺組織于Bouin’s固定液(飽和苦味酸-甲醛-冰醋酸=75∶25∶5)中固定24h，再用無(wú)水乙醇浸泡至肺組織顏色恢復(fù)，轉(zhuǎn)移灶為白色結(jié)節(jié)，記錄肺轉(zhuǎn)移瘤灶的數(shù)目。

肺轉(zhuǎn)移抑制率(%)=(對(duì)照組平均肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)-治療組平均肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù))/對(duì)照組平均肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)×100%

瘤體處理：切取瘤體組織約5g，于培養(yǎng)皿上以100目不銹鋼濾網(wǎng)上研磨，以PBS液反復(fù)濾過(guò)沖洗10次，濾液經(jīng)300目濾紙過(guò)濾至流式管中，離心1 200rpm×5min，棄上清。加入2mL PBS液吹打分裝成3管，離心1 200rpm×5min，棄上清，分別作Bcl-2、Caspase-3、CyclinD1檢測(cè)用。

Bcl-2檢測(cè)方法[4]：于樣品中加入1mL 2%多聚甲醛固定，放置15min，離心(1 200rpm× 5min)，加入1mL 0.1%TritonX-100(破膜劑)，放置15min，離心棄上清液，加入BSA 2mL洗滌，離心棄上清液，加入Bcl-2抗體(1∶50稀釋)100μL，混勻，室溫放置20min，加入BSA 2mL洗滌1次，棄上清液，加入1mL PBS上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

Caspase-3檢測(cè)方法[5]：于樣品中加入1mL 2%多聚甲醛固定，放置15min，離心(1 200rpm× 5min)，加入1mL 0.1%TritonX-100(破膜劑) ，放置15min，離心棄上清液，加入BSA 2mL洗滌，離心棄上清液，加入Caspase-3抗體(1∶50稀釋)100μL，混勻，室溫放置20min，加入BSA 2mL洗滌一次，棄上清液，加入二抗(1∶50稀釋)5μL，混勻，室溫放置20min，加入BSA 2mL洗滌1次，棄上清液，加入1mL PBS上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

CyclinD1檢測(cè)方法[6]：于樣品中加入1mL 70%乙醇固定，放置15min，離心(1 200rpm×5min)，加入1mL 0.1%TritonX-100(破膜劑) ，放置15min，離心棄上清液，加入BSA 2mL洗滌，離心棄上清液，加入CyclinD1抗體(1∶50稀釋)100μL，混勻，室溫放置20min，加入BSA 2mL洗滌一次，棄上清液，加入1mL PBS上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

四組小鼠移植瘤株后存活并生長(zhǎng)。

2.1 瘤重和抑瘤率

巖龍膠囊對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞荷瘤小鼠干預(yù)治療后，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的瘤體重量明顯減小，與陰性對(duì)照組對(duì)比，分別為P<0.05和P<0.001。低劑量組與陰性對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。巖龍膠囊高、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的抑瘤率分別為19.41%、8.68%、39.34%。詳見(jiàn)表1。

表1 巖龍膠囊對(duì)肺癌小鼠瘤體重量和抑瘤率的影響 (n=10)

注：與陰性對(duì)照組比較：*P<0.05 ，***P<0.001。

2.2 肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)和肺轉(zhuǎn)移抑制率

巖龍膠囊對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞荷瘤小鼠干預(yù)治療后，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少，與陰性對(duì)照組對(duì)比，分別為P<0.05和P<0.001。低劑量組與陰性對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。巖龍膠囊高、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的肺轉(zhuǎn)移抑制率分別為40%、32.4%、53.3%。見(jiàn)表2。

表2 巖龍膠囊對(duì)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)和肺轉(zhuǎn)移抑制率的影響 (±s)

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，***P<0.001。

2.3 Bcl-2、Caspase-3和CyclinD1的表達(dá)

巖龍膠囊對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞荷瘤小鼠干預(yù)治療后，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組能明顯降低細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl-2和細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)，同時(shí)能提高細(xì)胞凋亡基因Caspase-3的表達(dá)。巖龍膠囊高劑量組與陰性對(duì)照組比較，對(duì)Bcl-2、Caspase-3和CyclinD1的影響中P值分別為P<0.01、P<0.001、P<0.05。陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，對(duì)Bcl-2、Caspase-3和CyclinD1的影響中P值分別為P<0.001、P<0.001、P<0.01。低劑量組與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表3。

表3 巖龍膠囊對(duì)肺癌小鼠Bcl-2、Caspase-3及CyclinD1表達(dá)的影響 (±s，n=10)

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

巖龍膠囊的組方體現(xiàn)了李巖教授早在20多年前中醫(yī)腫瘤組方的特點(diǎn)，不但考慮整體觀念，而且重視“辨證與辨病”相結(jié)合。Ⅰ期和Ⅱ期實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明了巖龍膠囊對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞荷瘤小鼠有一定的抑制腫瘤生長(zhǎng)和抗肺轉(zhuǎn)移作用。然而，巖龍膠囊的組方是針對(duì)多種惡性腫瘤使用的，在“辨證”上是以蛇莓、龍葵、白英同為君藥，以當(dāng)歸、郁金、丹參同作臣藥和佐藥之用，共奏以清熱解毒化瘀為主、扶正為輔之功。在“辨病”的抗癌作用上，既往大量實(shí)驗(yàn)證明方中各藥均有較強(qiáng)的作用，如蛇莓水提物抗人體肝癌(7721)、胃癌(7901)、食管癌(Eca109)、卵巢癌(SKOV-3)、宮頸癌(Hela)、子宮內(nèi)膜癌(HEC-1B)、鼻咽癌(BGC-823)、肺癌(NCI-H460)等癌細(xì)胞；龍葵抗乳腺癌(MCF-7)、肝癌(SMMC-7721，HepG2)、胃癌(MGC-803)、肉瘤(S180)等癌細(xì)胞；白英抗卵巢癌(HO-8910)、宮頸癌(Hela)、肉瘤(S180)(肝癌H22)、白血病(K562)、鼻咽癌(HONE-1)、口腔上皮癌(KB)、腸癌(HT29)等癌細(xì)胞；郁金抗白血病(HL60、K562)、胃癌(SGC 7902、MGC 803)、肝癌(Bel 7402)、結(jié)腸癌(SW620)等癌細(xì)胞；丹參抗舌癌(TCA-83)、肝癌(Ang-2、HepG2)、乳腺癌(MDA-MB-231)、肺癌(NCI-H460)、腸癌(LoVo)、宮頸癌(Hela)膽管癌(HCCC-9810)、前列腺癌(DU145)、子宮內(nèi)膜癌(KLE)等癌細(xì)胞。 因此,本方對(duì)多種惡性腫瘤都有較好的療效。

Bcl-2基因家族是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因，包括Bcl-2、Bcl-X和Bax，三者形成細(xì)胞調(diào)亡的其中一個(gè)調(diào)控系統(tǒng)，其中Bcl-2屬抗調(diào)亡基因，其表達(dá)的產(chǎn)物可增加多種促調(diào)亡因素的抗性，而延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命。其抑制調(diào)亡的機(jī)制可能與下列因素有關(guān)：①抗氧化作用，抑制細(xì)胞超氧化物的積累；②與Bax的產(chǎn)物形成異源二聚體Bax/ Bcl-2后，等于減少了導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡的Bax/Bax同源二聚體的形成；③影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+重新分布，而抑制了某些Ca2+依賴的酶發(fā)揮酶解活性[7]。本實(shí)驗(yàn)中巖龍膠囊能明顯降低該基因的表達(dá)，提示巖龍膠囊可以通過(guò)降低Bcl-2以促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，可作為其抑制腫瘤一種機(jī)制。

Caspase-3基因是與細(xì)胞凋亡有關(guān)基因的ICE家族(Caspase-1 ～11)中的一員。該家族的成員都具有胱氨酸蛋白酶的活性，可促使細(xì)胞調(diào)亡。Caspase的激活途徑有兩個(gè)：①死亡受體途徑：細(xì)胞表面Fas、TNF-α、TRAIL受體與相應(yīng)配體結(jié)合后，可通過(guò)活化相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域及死亡效應(yīng)域，順應(yīng)激活Caspase-8和Caspase-10、Caspase-6、Caspase-7，最后是Caspase-3而導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡；②線粒體途徑：細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C凋亡交互因子(CIFA)分解線粒體中細(xì)胞色素C后，細(xì)胞色素C與Caspase(Apaf-1)結(jié)構(gòu)域中的P環(huán)結(jié)合，并激活Caspase-9，再激活Caspase-3而導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡[7]。實(shí)驗(yàn)中巖龍膠囊能明顯提高該基因的表達(dá)，提示巖龍膠囊可以通過(guò)提高Caspase-3以促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，可作為其抑制腫瘤的另一種機(jī)制。

CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白中CyclinD家族中的三個(gè)亞型(D1、D2、D3)之一，是腫瘤細(xì)胞正調(diào)控因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換。CyclinD1與CDK4或CDK6形成復(fù)合物后激活CDK,并通過(guò)磷酸化其下游關(guān)鍵底物Rb,使其釋放出結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F,促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞跨過(guò)G1-S監(jiān)測(cè)點(diǎn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。正常組織中CyclinD1表達(dá)較低或不表達(dá)，而腫瘤組織中常有CyclinD1的擴(kuò)增、重排、以及突變，導(dǎo)致蛋白表達(dá)產(chǎn)物增多，是多種惡性腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要的因素[8]。本實(shí)驗(yàn)中巖龍膠囊能明顯降低該基因的表達(dá)，提示巖龍膠囊可以通過(guò)降低CyclinD1以降低癌細(xì)胞增殖，可作為其抑制腫瘤的一種機(jī)制。

綜上所述，結(jié)合兩期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，巖龍膠囊對(duì)CD4、CD44V6、Bcl-2、Caspase-3和CyclinD1的干預(yù)，表明了其對(duì)惡性腫瘤的抑瘤機(jī)制是多角度和多靶點(diǎn)的，也反映了中醫(yī)中藥治療惡性腫瘤的復(fù)雜機(jī)制。

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

2014-11-23

盧秀梅(1974-),女,博士,研究方向?yàn)橹嗅t(yī)治療腫瘤。

吳萬(wàn)垠(1964-)，男，博士,廣東省中醫(yī)院教授，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療腫瘤。

R285.5

A

1673-2197(2015)09-0006-03

10.11954/ytctyy.201509003