徐 微，李啟紅，李 嶺，孫 淼，李俊平，楊承槐，李慧姣

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

雞傳染性貧血病毒VP1、VP2基因的表達(dá)及免疫原性研究

徐 微，李啟紅，李 嶺，孫 淼，李俊平，楊承槐?，李慧姣?

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

為探索雞傳染性貧血重組蛋白亞單位疫苗的可行性，將雞傳染性貧血病毒基因分別克隆到轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA中，再將其分別轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞得到相應(yīng)的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf21獲得含有VP1、VP2基因的重組桿狀病毒vBac－VP1、vBac－VP2，應(yīng)用懸浮培養(yǎng)的Sf21細(xì)胞表達(dá)重組蛋白。SDS－PAGE及Western blotting結(jié)果證明，VP1、VP2基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中得到了表達(dá)，動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，重組蛋白免疫SPF雞可產(chǎn)生ELISA抗體，提示桿狀病毒表達(dá)的VP1、VP2具有良好的免疫原性。

雞傳染性貧血病毒；桿狀病毒表達(dá)；VP1；VP2；免疫原性

雞傳染性貧血（chicken infectious anemia，CIA）又稱藍(lán)翅病，是由圓環(huán)病毒科雞傳染性貧血病毒（CIAV）引起的以雛雞再生障礙性貧血和全身性淋巴組織萎縮為主要特征的免疫抑制?。?］。CIAV于1979年由Yuasa等人首次發(fā)現(xiàn)并分離［2］，其后迅速傳至世界各地，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大損失，被列為世界重要禽病研究行列。

CIAV的基因組是一環(huán)形、單股、負(fù)鏈DNA，大小約為2.3 kb。全基因組包括部分重疊或完全重疊的三個(gè)開(kāi)放讀碼框架（open reading frame，ORFs），分別由1347、648、363 nt組成，編碼著VP1（52 kD）、VP2（24 kD）和 VP3（14 kD）蛋白［3］。VP1蛋白是CAV的唯一衣殼蛋白和主要免疫原蛋白，而VP2是VP1的輔助蛋白，能幫助VP1形成正確的構(gòu)象，二者相互協(xié)調(diào)才能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用［4］。據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道，單獨(dú)表達(dá)的 VP1蛋白抗體反應(yīng)較弱［5］，共同表達(dá)的VP1、VP2蛋白具有確實(shí)的免疫原性［6］，如利用桿狀病毒在貼壁培養(yǎng)的 Sf9中表達(dá) CIAV M9905株的 VP1、VP2蛋白［7］，但目前尚無(wú)將VP1、VP2重組蛋白與實(shí)際疫苗生產(chǎn)實(shí)踐相結(jié)合的報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)利用基因工程技術(shù)，將雞傳染性貧血病毒cux－1株的VP1、VP2的基因分別單獨(dú)連接到載體中，采用重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在懸浮培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf21中表達(dá)目的蛋白，將獲得目的蛋白進(jìn)行純化和功能鑒定后，按照生物制品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程制備油乳劑滅活疫苗用于免疫動(dòng)物并分析免疫效果，借以研究重組蛋白的免疫原性和分析用作亞單位疫苗的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌種和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFastBacHTA（pFBH）由本室保存，pFBH－VP1、pFBH－VP2插入基因分別為CIAV cux－1株的VP1、VP2基因；TOP10感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞由北京畜牧獸醫(yī)研究所李剛教授惠贈(zèng)；SPF雞購(gòu)自梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoR I、SpeI、XhoI、KpnI，T4連接酶購(gòu)自NEB公司，Ex Taq試劑盒購(gòu)自大連 TaKaRa生物工程公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectaminTM2000購(gòu)自 Invitrogen公司，昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基Sf900 II SFM、Grace’s購(gòu)自GIBCO BRL公司，胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司

1.1.3 試劑盒 高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，Wizard Genomic DNA Purification Kit購(gòu)自Promega公司，CIAV抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天之泰生物科技有限公司。

1.1.4 CIAV及其陽(yáng)性血清 CIAV cux－1株由本室保存，其多克隆陽(yáng)性血清購(gòu)自Charles river laboratories。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已發(fā)表的基因組序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增雞傳染性貧血病毒cux－1株的VP1及VP2基因引物，由上海生工生物工程有限公司合成。VP1－F：5’－CCGGAATTCGCCACCATGGCAAGACGAGCTCGCAGAC－3’，VP1－R：5’－CTA?GACTAGTCCTTAGGGCTGCGTCCCCCAG－TACATG－3’，VP2－F：5’－CCGCTCGAGGATGCACGGGAACG?GCGCACAAC－3’，VP2－R：5’－GGGG－TACCCCT?TACACTATACGTACCGGGG－3’，其中VP1上下游分別引入EcoR I、SpeI酶切位點(diǎn)，VP2上下游分別引入XhoI、KpnI酶切位點(diǎn)。

1.2.2 DNA模板提取 采用Wizard Genomic DNA Purification Kit進(jìn)行。

1.2.3 VP1基因的克隆 PCR反應(yīng)體系：CIAV DNA 2 μL，dNTPs 2 μL，10×Ex Taq buffer 2.5 μL，引物VP1－F和VP1－R各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.125 μL，ddH2O 16.375 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s，62.8℃退火40 s，72℃延伸1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。

1.2.4 VP2基因的克隆 PCR反應(yīng)體系：CIAV DNA 2 μL，dNTPs 2 μL，10×Ex Taq buffer 2.5 μL，引物VP2－F和VP2－R各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.125 μL，ddH2O 16.375 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s，62.8℃退火40 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。

1.2.5 基因測(cè)序及序列分析 PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收后，分別連接到pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒pMD18T－VP1，pMD18T－VP2。將酶切及PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒送Invitrogen公司測(cè)序，并用序列分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.6 重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建 pMD18T－VP1、pMD18T－VP2經(jīng)測(cè)序正確后，使用限制性內(nèi)切酶EcoR I、SpeI分別雙酶切pMD18T－VP1及轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒 pFastBacHTA后連接，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFBH－VP1；使用限制性內(nèi)切酶XhoI、KpnI分別雙酶切pMD18T－VP2及轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFastBacHTA后連接，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFBH－VP2。以上重組載體均用雙酶切及PCR鑒定。

1.2.7 重組表達(dá)載體構(gòu)建 重組轉(zhuǎn)移載體鑒定正確后，將 pFBH－VP1、pFBH－VP2分別轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑和慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素三抗篩選之后，獲得重組表達(dá)載體Bacmid DNA，使用M13通用引物與VP1、VP2基因特異引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.8 重組桿狀病毒產(chǎn)生 經(jīng)鑒定載體重組正確后，按照LipofectaminTM2000操作說(shuō)明，將Bacmid－VP1、Bacmid－VP2分別轉(zhuǎn)染Sf21昆蟲(chóng)細(xì)胞，混合孵育5 h后棄去轉(zhuǎn)染混合物，加入Sf900 II SFM培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時(shí)，收集培養(yǎng)液，1500 r／min離心10 min后收集上清，加入2%～4%的胎牛血清，4℃避光保存，即為 P1代毒。按MOI＝0.1將P1代毒接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（密度為1×106～2×106細(xì)胞／mL）的Sf21細(xì)胞，28℃培養(yǎng)72 h收獲P2代毒，同樣方法接P2代毒，收獲P3代毒，用于重組蛋白表達(dá)。

1.2.9 重組桿狀病毒鑒定 提取病毒液中的病毒DNA，用M13通用引物與VP1、VP2基因特異引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.10 重組蛋白表達(dá)及鑒定 將懸浮培養(yǎng)的Sf21細(xì)胞調(diào)整至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按MOI＝5接種P3代毒，將重組桿狀病毒vBac－VP1、vBac－VP2共同感染細(xì)胞，于28℃ 125 r／min搖床中培養(yǎng)，24、48、72、96、120和144 h分別收獲細(xì)胞及上清，裂解后用10%的分離膠進(jìn)行SDS－PAGE蛋白電泳，分別考馬斯亮藍(lán)染色及Western blotting觀察結(jié)果。

1.2.11 重組蛋白免疫原性研究 按照生物制品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程將vBac－VP1、vBac－VP2共感染表達(dá)產(chǎn)物制成油乳劑滅活疫苗。經(jīng)胸部肌肉接種5周齡SPF雞三只，同時(shí)設(shè)等量對(duì)照。于免疫后21 d采血并分離血清，利用ELISA試劑盒檢測(cè)抗體效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 VP1、VP2基因的PCR擴(kuò)增 分別使用VP1、VP2特異性引物對(duì)病毒DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)分別出現(xiàn)1350 bp及651 bp片段，與預(yù)期片段大小相符（圖1和圖2）。

圖1 VP1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 VP2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 基因測(cè)序及序列分析 使用序列分析軟件對(duì)重組質(zhì)粒pMD18T－VP1、pMD18T－VP2測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，得到二者與目的基因同源性均達(dá)到99%。

2.3 重組轉(zhuǎn)移載體鑒定 利用各載體特異性的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定及 PCR鑒定結(jié)果均表明，CIAV的VP1、VP2基因正確插入各重組質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，且方向正確。

2.4 重組表達(dá)載體鑒定 重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化DH10Bac細(xì)胞經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，提取桿粒，利用用M13通用引物與VP1、VP2基因特異引物進(jìn)行PCR鑒定，Bacmid－VP1經(jīng)M13－F／VP1－R為引物擴(kuò)增后出現(xiàn) 3100 bp片段，與理論值相符（圖 3）；Bacmid－VP2經(jīng)M13－F／VP2－R為引物擴(kuò)增后出現(xiàn)2478 bp片段，與理論值相符（圖4），證明重組表達(dá)載體正確構(gòu)建。

圖3 Bacmid－VP1的PCR鑒定結(jié)果

圖4 Bacmid－VP2的PCR鑒定結(jié)果

2.5 重組桿狀病毒構(gòu)建 對(duì)收獲的細(xì)胞培養(yǎng)上清提取病毒DNA，利用M13通用引物與VP1、VP2基因特異引物進(jìn)行PCR鑒定。

2.6 重組蛋白的鑒定 分別于感染后24、48、72、96、120和144 h收獲三種不同表達(dá)載體感染Sf21細(xì)胞所得產(chǎn)物，SDS－PAGE電泳分析表明，重組桿狀病毒vBac－VP1、vBac－VP2共同感染細(xì)胞后72 h開(kāi)始表達(dá)目的蛋白VP1、VP2，大小分別為60 kD和29 kD左右，直至140 h仍有表達(dá)（圖5），經(jīng)Western blotting分析，均出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶。

圖5 重組桿狀病毒vBac－VP1、vBac－VP2共同感染表達(dá)產(chǎn)物

2.7 重組蛋白的免疫原性 經(jīng)ELISA試劑盒檢測(cè)，對(duì)照組全部為陰性，免疫組全部為陽(yáng)性，平均抗體效價(jià)9966。

3 討論

CIAV感染雛雞可引起嚴(yán)重貧血，滲出性皮炎和死亡，特別是導(dǎo)致全身性淋巴組織萎縮引起免疫抑制而繼發(fā)感染或二重感染，降低其它疫苗的免疫效果。野生型CIAV雖然能在MDCC－MSB1細(xì)胞或雞胚上增殖，但通過(guò)MSB1細(xì)胞連續(xù)傳代降低其毒力后對(duì)于雛雞來(lái)講致病性仍然較強(qiáng)，比如國(guó)外生產(chǎn)的Cux－1株弱毒苗，接種雛雞仍然可以導(dǎo)致CIA的發(fā)生［8］；另一方面，CIAV在MSB1細(xì)胞中病毒滴度較低，而通過(guò)雞胚傳代獲得的病毒量也不高，使CIA滅活疫苗的生產(chǎn)成本很高，難以在養(yǎng)雞業(yè)大量推廣應(yīng)用，同時(shí)CIAV對(duì)各種理化因子具有很強(qiáng)抵抗性而很難將其全部滅括，在其他常規(guī)雞胚苗的生產(chǎn)過(guò)程中，往往有活的CAV存在，引起嚴(yán)重的二次感染，因此，給常規(guī)疫苗的研制帶來(lái)了很大困難。故近年來(lái)，基因工程疫苗研制已成為CIAV研究的重點(diǎn)領(lǐng)域之一，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)［9］以及在家蠶中的表達(dá)［8］。

本研究所使用的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（baculovirus expression vector system，BEVS）是一個(gè)利用桿狀病毒作為載體，在昆蟲(chóng)培養(yǎng)細(xì)胞或蟲(chóng)體中表達(dá)外源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)。具有安全性高、真核修飾環(huán)境、容量大、表達(dá)量高等特點(diǎn)，自 Smith GE等于1983年利用AcNPV成功表達(dá)外源蛋白以來(lái)，經(jīng)過(guò)30年的發(fā)展，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成為當(dāng)今基因工程四大表達(dá)系統(tǒng)（桿狀病毒、大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)）之一。

本研究利用Bac－to－Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建單獨(dú)表達(dá)CIAV VP1、VP2基因的重組桿狀病毒 vBac－VP1、vBac－VP2。利用 vBac－VP1、vBac－VP2共同感染細(xì)胞后收獲表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)SDSPAGE蛋白電泳分析表明重組表達(dá)蛋白VP1、VP2大小分別為 60 kD和 29 kD左右，經(jīng) Western blotting分析證明，重組VP1、VP2蛋白能與CIAV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，具有良好的抗原性。將重組表達(dá)產(chǎn)物制備為油乳劑滅活疫苗免疫SPF雞，21 d后ELISA檢測(cè)抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，這說(shuō)明桿狀病毒表達(dá)的CIAV VP1、VP2蛋白具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。本研究初步證明采用Bac－to－Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的CIAV cux－1株VP1和VP2蛋白具有較好的免疫原性，且通過(guò)按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程制備油乳劑滅活苗，進(jìn)一步將重組蛋白表達(dá)與生產(chǎn)實(shí)際相聯(lián)系，具有較好的應(yīng)用前景。故該重組蛋白可以用于中和抗體檢測(cè)，檢測(cè)群體的免疫水平，也為進(jìn)一步開(kāi)展亞單位疫苗生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

［1］李文濤，王宏偉，韓少杰.傳染性貧血?。跩］.養(yǎng)禽與禽病防治，2005，10：36－37.

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［3］翟新驗(yàn)，盧勝明.雞貧血病毒［C］／／中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，2002：336－338.

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（編 輯：李文平）

Expression of VP1 and VP2 Genes of Chicken Anemia Virus and Immunogenicity Research

XU Wei1，LI Qi－h(huán)ong，LI Ling，SUN Miao，LI Jun－ping，YANG Cheng－h(huán)uai?，LI Hui－jiao?
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing100081，China）

The VP1 and VP2 genes of chicken anemia virus were cloned into pFastBacHTA vectors separately，then transformed into competent cells ofE.coliDH10Bac.The recombinant baculoviruses vBac－VP1 and vBac－VP2were generated by transfection of recombinant bacmid into Sf21 insect cells.Finally，recombinant proteins were expressed in suspension culture Sf21 cells.SDS－PAGE and Western blotting showed that VP1 and VP2 have been expressed in Sf21 cells.Immunized the SPF chicken with recombinant protein，their serum were inspected by ELISA and showed good immunogenicity.

chicken anemia virus；baculovirus expression；VP1；VP2；immunogenicity

2014－10－10

A

1002－1280（2015）04－0007－05

S852.65

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)“重大動(dòng)物疫病病原及相關(guān)制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究（2008FY130100）”

徐 微，碩士研究生，從事禽病研究。

楊承槐，E－mail：ychenghuai＠163.com；李慧姣，E－mail：lihuijiao＠ivdc.org.cn