蔣依倩齊 宇劉文賢姜秀云高云航徐鳳宇?

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，長春130118）

分枝桿菌噬菌體CJAUS5株holin基因的克隆與序列分析

蔣依倩1，2，齊 宇1，劉文賢1，2，姜秀云1，3，高云航1，2，徐鳳宇1，2?

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，長春130118）

為了研究噬菌體裂解宿主菌的機(jī)制，開發(fā)噬菌體裂解相關(guān)蛋白的應(yīng)用價值，試驗參照GenBank中登錄的holin基因序列設(shè)計特異性引物，以分枝桿菌噬菌體CJAUS5基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出411 bp的條帶。構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19－T－h(huán)olin，經(jīng)雙酶切鑒定呈陽性后進(jìn)行測序分析。結(jié)果顯示，克隆出的holin基因與已知分枝桿菌肌尾噬菌體holin序列同源性高達(dá)99.03%～99.51%；編碼的氨基酸同源性高達(dá)99%～100%。對holin基因編碼的蛋白進(jìn)行分析表明，Holin蛋白具有親水性C端和兩個跨膜區(qū)域。研究成功克隆了分枝桿菌噬菌體CJAUS5的holin基因并進(jìn)行了氨基酸序列分析，為進(jìn)一步研究Holin蛋白的生物學(xué)特性及功能奠定了基礎(chǔ)。

分枝桿菌；噬菌體；holin；基因克隆；序列分析

Key words：mycobacterium；bacteriophage；holin；gene cloning；sequence analysis

分枝桿菌包括結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌三大菌群，目前發(fā)現(xiàn)的已有150多個種，其中一些種可引起多種動物及人類疾病，包括結(jié)核病、麻風(fēng)病以及副結(jié)核病等，給畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時還嚴(yán)重威脅著人類健康。隨著全球性細(xì)菌耐藥問題的出現(xiàn)，耐藥結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量不斷增多，尤其多藥耐藥結(jié)核?。∕DR－TB）和超級耐藥結(jié)核病（XDR－TB）的出現(xiàn)使得對新型抗結(jié)核藥物的需求更加迫切［1］。

噬菌體是一種能特異性感染細(xì)菌、在宿主體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和繁殖的病毒，是地球上最豐富的物種［2］，幾乎有細(xì)菌生存的環(huán)境就存在有相應(yīng)的噬菌體［3］。噬菌體可以通過在感染周期末編碼合成細(xì)胞壁水解酶（lysins）來裂解宿主菌釋放子代噬菌體［4］。噬菌體裂解酶作為一種新型殺菌制劑，與抗生素相比，它具有使用劑量小，特異性強(qiáng)等優(yōu)點［5］。然而，噬菌體裂解宿主不僅需要裂解酶還需要另一種蛋白—穿孔素（Holin）。Holin蛋白是噬菌體基因編碼的小分子膜蛋白，可以在宿主菌細(xì)胞膜上形成跨膜孔，這個“孔洞”是噬菌體裂解酶穿過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞壁破壞肽聚糖的通道［6］。Holin蛋白不僅是構(gòu)成跨膜孔的重要元件，還是觸發(fā)細(xì)菌裂解的“分子定時器”，在噬菌體的裂菌過程中扮演著關(guān)鍵角色［7］。

本研究以分枝桿菌噬菌體CJAUS5基因組為模板，克隆了holin基因，并進(jìn)行了序列分析，為進(jìn)一步研究Holin蛋白的生物學(xué)特性、功能及探討其潛在的應(yīng)用價值奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 噬菌體CJAUS5由本實驗室分離鑒定并保存；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞（由本實驗室制備并保存）；克隆載體pMD19－T（購于大連寶生物工程有限公司）。

1.2 試劑 限制性核酸內(nèi)切酶（BamHI、EcoRI）、ExTaq DNA聚合酶、T4DNA連接酶（大連寶生物工程有限公司）；Tris、EDTA（BBI公司）；氨芐青霉素、瓊脂（北京鼎國生物工程公司）；7H9液體培養(yǎng)基（BD醫(yī)療器械有限公司）；質(zhì)粒小提試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；凝膠回收試劑盒（杭州維特潔生化技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的分枝桿菌肌尾噬菌體Ava3（GenBank：JQ911768.1）和Drazdys（GenBank：JF704116.1）的holin基因序列設(shè)計引物，送生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列如下：上游P1：5’－GCAGGATCCAT?GAAGTACTCACCCGC－3’，劃線部分為BamH I酶切位點；下游P2：5’－CGGAATTCTCATCGCTTCAA? CACGGA－3’，劃線部分為EcoR I酶切位點。

1.3.2 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 反應(yīng)體系：CJAUS5噬菌體基因組模板DNA2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，2.5 mmol／L dNTP2.0 μL，ExTaq酶0.3 μL，10×ExTaq buffer 2.5 μL，ddH2O17.2 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，95℃變35 s，64℃退45 s，72℃延40 s，30個循環(huán)，72℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的條帶。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定 按凝膠回收試劑盒說明書回收純化PCR產(chǎn)物，將其與pMD19－T載體連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，按索萊寶質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒后，經(jīng)PCR、雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pMD19－T－h(huán)olin的正確性。

1.3.4Holin基因的測序與分析 將鑒定正確的陽性重組克隆質(zhì)粒pMD19－T－h(huán)olin送至生工生物工程（上海）有限公司測序。測序結(jié)果應(yīng)用BLAST軟件與GenBank中同源性較高的毒株相應(yīng)序列進(jìn)行比對及相關(guān)功能分析；利用DNAStar中MegAlign功能建立系統(tǒng)發(fā)育樹，分析序列之間的同源性；運用DNAStar軟件對Holin蛋白進(jìn)行蛋白特性預(yù)測；運用在線分析程序ProtScale分析Holin蛋白的親疏水性；運用在線工具TMHMM Server 2.0分析Holin蛋白的跨膜區(qū)；利用蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測工具I－TASSER預(yù)測Holin蛋白可能形成的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1holin基因的擴(kuò)增 以分枝桿菌噬holin菌體CJAUS5基因組DNA為模板，以P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見1條約400 bp左右的DNA片斷（圖1），與試驗預(yù)期的目的DNA片斷大小相一致。

圖1 CJAUS5的holin基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與雙酶切鑒定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用試劑盒純化后，與pMD19－T載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，少量提取質(zhì)粒用EcoR I和BamH I進(jìn)行雙酶切鑒定。電泳結(jié)果表明，重組質(zhì)粒分別被酶切成兩條帶，一條約為2700 bp，與pMD19－T空載體大小吻合，另一條約400 bp左右，與holin基因擴(kuò)增片段大小一致（圖 2）。說明克隆載體pMD19－T－h(huán)olin構(gòu)建成功。

2.3holin基因的序列測定與同源性分析 測序結(jié)果表明，去除酶切位點和保護(hù)堿基后，分枝桿菌噬菌體CJAUS5的holin基因大小為411 bp，可編碼136個氨基酸。用BLAST軟件對測序結(jié)果進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，所得序列與GenBank中已知分枝桿菌肌尾噬菌體holin序列相似性高達(dá) 99.03%～99.51%，編碼的氨基酸序列同源性高達(dá) 99%～100%，其中 MBP－Ghost（GenBank：JF704096.1）、MBP－Nappy（GenBank：JN699627.1）、MBP－Drazdys（GenBank：JF704116.1、MBP－ArcherS7（GenBank：KC748970.1）的holin基因與 CJAUS5噬菌體的holin基因同源性最高，達(dá)99.51%。運用MegAlign軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）發(fā)現(xiàn)，CJAUS5的holin基因與大多數(shù)分支桿菌肌尾噬菌體的holin基因處于同一分支，說明CJAUS5的holin基因與它們親緣關(guān)系較近。

圖2 陽性重組質(zhì)粒pMD19－T－h(huán)olin的雙酶切鑒定結(jié)果

圖3 CJAUS5的holin系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 Holin的蛋白的特性預(yù)測 應(yīng)用DNAStar軟件的protean功能對CJAUS5的holin基因編碼的蛋白進(jìn)行蛋白特性預(yù)測，結(jié)果表明：Holin蛋白相對分子質(zhì)量為13802.07，等電點為5.77；整個蛋白中酸性氨基酸出現(xiàn)的頻率為8.09%，堿性氨基酸出現(xiàn)的頻率為7.35%，極性氨基酸出現(xiàn)的頻率為18.38%，疏水氨基酸出現(xiàn)的頻率為50.74%，蛋白在pH＝7.00時帶 0.92個單位的負(fù)電荷；其二級結(jié)構(gòu)中（Gmier分析方法）α－螺旋占37.50%，β－折疊占58.10%，轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲占5.15%（圖4）。

圖4 CJAUS5－Holin蛋白特性預(yù)測

2.5 CJAUS5－Holin蛋白的親疏水性分析 運用在線分析程序ProtScale分析Holin蛋白的親疏水性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白大約在11～26、40～58位氨基酸之間含有典型的疏水性區(qū)域（圖5）。

圖5 CJAUS5－Holin蛋白親疏水性分析

2.6 CJAUS5－Holin的跨膜區(qū)分析 Holin蛋白根據(jù)其拓?fù)洚悩?gòu)學(xué)的不同可劃分為三類，最大的兩類是第I類和第Ⅱ類，其中第I類有3個跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrance domain，TMD）；第Ⅱ類有 2個TMD。第I類和第Ⅱ類眾多不相關(guān)基因家族中，有一種基因家族的T4穿孔素gpt和與它有親緣關(guān)系的T－偶數(shù)噬菌體的相關(guān)穿孔素被歸為第Ⅲ類，它們只有1個TMD［8］。運用在線網(wǎng)絡(luò)工具分析TM?HMM Server 2.0分析Holin蛋白的跨膜區(qū)，結(jié)果顯示Holin蛋白的1～6、59～136位氨基酸處于胞內(nèi)部分，27～35位氨基酸處于胞外部分，7～26、36～58位氨基酸之間形成了兩個典型的跨膜螺旋區(qū)（圖6），說明分枝桿菌噬菌體CJAUS5的Holin蛋白屬于第Ⅱ類。

圖6 CJAUS5－Holin跨膜區(qū)域分析

2.7 CJAUS5－Holin的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測工具I－TASSER對CJAUS5噬菌體Holin蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)的可能性預(yù)測，結(jié)果見下（圖7）。

2.8 CJAUS5－h(huán)olin的核苷酸保守區(qū)域分析 應(yīng)用NCBI中的BLAST工具對CJAUS5噬菌體holin的核苷酸序列進(jìn)行保守區(qū)域分析，結(jié)果顯示CJAUS5的holin核苷酸序列含有 PRP38_assoc超家族pfam06495保守區(qū)域，該區(qū)域為植物和后生動物前體mRNA剪接因子38相關(guān)的C端親水性區(qū)域。

圖7 CJAUS5－Holin三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖8 CJAUS5－h(huán)olin保守區(qū)域分析

3 討論

研究成功克隆了分枝桿菌噬菌體CJAUS5的holin基因，通過BLAST比對軟件發(fā)現(xiàn)它與GenBank中其它分枝桿菌肌尾噬菌體相關(guān)基因的核苷酸及氨基酸序列同源性很高，說明該基因序列非常保守；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明CJAUS5－h(huán)olin與大多數(shù)肌尾噬菌體的holin基因處于同一分支，這說明CJAUS5的holin基因與它們有較近的親緣關(guān)系；對Holin蛋白進(jìn)行親疏水性，發(fā)現(xiàn)該蛋白大約在11～26、40～58位氨基酸之間含有典型的疏水性區(qū)域；跨膜區(qū)分析結(jié)果顯示，Holin蛋白1～6、59～136位氨基酸處于胞內(nèi)部分，7～26、36～58位氨基酸之間形成了兩個典型的跨膜螺旋區(qū)，結(jié)合其疏水性區(qū)域走向，可以看出CJAUS5－Holin蛋白為跨膜蛋白；核苷酸序列保守區(qū)域分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CJAUS5－Holin核苷酸序列含有植物和后生動物前體mRNA剪接因子38相關(guān)的C端親水性區(qū)域（PRP38_assoc超家族），其走向與 Holin蛋白的胞內(nèi)部分吻合。由此可以說明CJAUS5－Holin蛋白是一個具有保守的親水性C端和兩個跨膜區(qū)域的膜蛋白，屬于第Ⅱ類Holin蛋白。這一結(jié)果與已知的分枝桿菌噬菌體Ms6－Holin樣蛋白的分析結(jié)果一致［9］。

雙鏈DNA噬菌體普遍采用穿孔素－裂解酶模式（holin－lysin system）降解細(xì)菌細(xì)胞壁，釋放出子代噬菌體。其中能為裂解酶穿過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞壁提供“通道”的跨膜蛋白Holin具有非常重要的作用。與傳統(tǒng)意義上的跨膜蛋白不同，Holin蛋白是由宿主體內(nèi)的噬菌體基因編碼而成的，噬菌體裝配階段，Holin蛋白分子在宿主細(xì)胞膜上積聚并且這一過程不會對宿主造成可察覺的影響，然后在一個特定時間，形成它們的一級結(jié)構(gòu)，從而引發(fā)宿主細(xì)胞膜局部破裂［10］。許多噬菌體在編碼Holin蛋白的同時，還編碼一個antiholin蛋白，它可以通過抑制Holin蛋白的作用來控制細(xì)菌裂解的時間。有時antiholin由具有數(shù)個氨基酸延伸形成的雙啟動N端的holin基因編碼，或者由另一個起始密碼子翻譯表達(dá)［11］，有時由一個獨立基因編碼［12］。

近年來，關(guān)于分枝桿菌噬菌體的研究發(fā)展迅速。截止目前共有5846株分枝桿菌噬菌體登錄在相應(yīng)網(wǎng)站上，其中有800株進(jìn)行了全基因測序，登錄到GenBank的有428株，而這些噬菌體中39.94%是2013年以來發(fā)現(xiàn)的，說明本領(lǐng)域的研究日益受到人們的重視。我國也有研究者從事該方面工作，但對holin基因的具體研究在國內(nèi)尚未見報道［13］。本研究克隆的分枝桿菌噬菌體holin基因及其基因序列編碼的蛋白分析，為進(jìn)一步研究分枝桿菌噬菌體裂解宿主的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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（編 輯：陳 希）

Cloning and Sequence Analysis of Mycobacteriophage CJAUS5 StrainholinGene

JIANG Yi－qian1，2，QI Yu1，LIU Wen－xian1，2，JIANG Xiu－yun1，3，GAO Yun－h(huán)ang1，2，XU Feng－yu1，2?

（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China；2.Key Laboratory of Animal Production，Product Quality and Security，Ministry of Education of the people’s Republic of China，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China；3.College of Life Science，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China）

In order to further research the mechanisms of phage lysis host bacteria and develop the value of phage lysis related protein.Specific primers were designed based on theholingene sequences of mycobacteriophage deposited in GenBank target segment（about 411 bp in length）was amplified by PCR with Mycobacteriophage CJAUS5 genome as a template.The segment was cloned into pMD19－T vector and sequencing the positive recombinant plasmid pMD19－T－h(huán)olinafterBamHI andEcoRI digestion.The results show thatholingene was successfully cloned and 99.03%to 99.51%sequence homology with other myoviridae mycobacteriophages’sholingene and 99%to 100%amino acid homology.The analysis results of the protein encoded byholingene show that it is a protein with a hydrophilic carboxy－terminal domain and two potential transmembrane domains.This research successfully cloned theholingene of mycobacteriophage CJAUS5 and analyzed the amino acid sequence which laid the foundation for the futher study of Holin protein.

2015－02－02

A

1002－1280（2015）04－0001－06

Q78

吉林省科技廳項目（20140204069NY）

蔣依倩，碩士，從事動物微生態(tài)制劑研究。

徐鳳宇。E－mail：Xvfengyv2002＠126.com