彭 亮，李詒光,2*，陳 杰，饒 毅，季巧遇，魏惠珍

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330006；2.江中藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌 330096)

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不同產(chǎn)地、不同品種間絞股藍(lán)總皂苷和總多糖含量比較研究

彭 亮1，李詒光1,2*，陳 杰1，饒 毅1，季巧遇1，魏惠珍1

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330006；2.江中藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌 330096)

目的：建立絞股藍(lán)中總皂苷、總多糖含量測定方法，比較不同產(chǎn)地、不同品種絞股藍(lán)中總皂苷、總多糖含量差異，為考察藥材內(nèi)在質(zhì)量提供依據(jù)。方法：采用紫外-可見分光光度法，以人參皂苷Re為對照品，于550nm波長處對絞股藍(lán)總皂苷吸光度進(jìn)行測定；以D-無水葡萄糖為對照品，于490nm波長處對絞股藍(lán)總多糖吸光度進(jìn)行測定。結(jié)果：人參皂苷Re在0.097 8～0.489mg 范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999 8)，平均回收率為97.79%，RSD為1.44%(n=6)；D-無水葡萄糖在0.0198～0.099mg 范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999 4)，平均回收率為99.58%，RSD為1.35% (n=6)。結(jié)論：該方法簡便可行、重復(fù)性好，適用于絞股藍(lán)中總皂苷、總多糖含量測定。不同產(chǎn)地絞股藍(lán)中總皂苷和總多糖含量差異較大，且不同品種間絞股藍(lán)總皂苷含量存在顯著性差異，但絞股藍(lán)總多糖含量與絞股藍(lán)品種無相關(guān)性。該結(jié)果可為絞股藍(lán)的質(zhì)量控制和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)研究提供參考依據(jù)。

絞股藍(lán)；總皂苷；總多糖；提??；含量測定

絞股藍(lán)為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草本植物Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.的根莖或全草[1-3]，又名七葉膽、天堂草、公羅鍋底、遍地生根等。該屬植物基源復(fù)雜、品種繁多，全世界約有16個種屬和3個變種，我國有14個種屬和3個變種[4]，廣泛分布于陜西、湖北、安徽、福建、云南、廣西等地。其味苦微甘，性涼，歸肺、脾、腎經(jīng)，具有清熱解毒、化痰止咳、益氣健脾、養(yǎng)陰生津、養(yǎng)心安神等功效[5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，絞股藍(lán)含有大量皂苷、多糖和黃酮類成分，此外還含有少量氨基酸、維生素和微量元素等，其中皂苷和多糖是其主要成分[6-7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)具有抗癌、抗氧化、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜止痛及抗?jié)兊茸饔?，可用于高血壓、高血脂、高血糖、脂肪肝等疾病的治療?/p>

絞股藍(lán)作為一種與人參相似的免疫增強(qiáng)劑，有“南方人參”的美譽(yù)，民間稱其為神奇的“不老長壽藥草”，且作為五加科以外唯一含有與人參皂苷相似結(jié)構(gòu)有效成分的植物，在保健食品和新型藥品研發(fā)上都有巨大的應(yīng)用前景，是一種新型藥食兩用植物資源[8-11]。目前，絞股藍(lán)還未被收載入藥典，其道地藥材的選擇也未確定，各產(chǎn)地的絞股藍(lán)質(zhì)量差別較大，影響了絞股藍(lán)藥材及其產(chǎn)品的療效，制約了絞股藍(lán)藥材資源的開發(fā)利用。目前，關(guān)于不同產(chǎn)地、不同品種間絞股藍(lán)總皂苷、總多糖含量比較的研究尚未見文獻(xiàn)報道。為進(jìn)一步評價絞股藍(lán)藥材的質(zhì)量，本研究采用HPLC法測定絞股藍(lán)中總皂苷、總多糖含量，并比較不同產(chǎn)地、不同品種間總皂苷、總多糖的含量差異，以期為絞股藍(lán)藥材的質(zhì)量控制及資源開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-1800紫外可見分光光度計(日本島津)；SK5200LH超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；AB204-N型精密分析天平(Mettler Toledo上海衡器有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.2 試藥

絞股藍(lán)藥材經(jīng)鑒定為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草本植物Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的根莖或全草，藥材來源見表1。人參皂苷Re對照品(批號為110754-201324，中國食品藥品檢定研究院)，D-無水葡萄糖對照品(批號為110833-200904，中國食品藥品檢定研究院)。水為純凈水，石油醚、冰醋酸、高氯酸、乙醇、正丁醇、硫酸等其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總皂苷含量測定

2.1.1 對照品溶液制備 取干燥至恒重的人參皂苷Re對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成濃度為0.489mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取絞股藍(lán)藥材干燥粉末(過四號篩)約1.5g，精密稱定，置于索氏提取器中，加石油醚(60～90℃) 適量，加熱回流至提取液無色，棄去石油醚液，藥渣連同濾紙揮干溶劑，藥渣移入具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇溶液60mL，回流提取2次，每次1.5h，過濾，合并濾液，蒸干，殘渣加適量熱水充分溶解，離心10min(3 500r/min)，取上清液，水層溶液用水飽和的正丁醇溶液萃取(4次×20mL)，合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

表1 絞股藍(lán)藥材樣品來源

2.1.4 最大吸收波長確定 將顯色后的對照品和供試品溶液于200～700nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示對照品和供試品溶液在550nm附近均有最大吸收。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定 精密吸取人參皂苷Re對照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分別置于10mL具塞試管中，60℃揮干溶劑，分別精密加入 5% 香草醛冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8mL，混勻，密塞，置于60℃水浴中15min，取出后立即用流水冷卻，加冰醋酸5mL，混勻，以空白試劑為對照，于550nm波長處測定吸收度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)Y，以對照品取樣量(mg)為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程為：Y=4.017 4X-0.039 9，R2=0.999 8(n=5)。結(jié)果表明，人參皂苷Re在0.097 8～0.489mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份人參皂苷Re對照品溶液，按照“2.1.5”項(xiàng)下方法操作，在同一條件下連續(xù)測定5次吸光度，分別為0.361、0.363、0.359、0.358、0.360，RSD為0.53%，表明精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取絞股藍(lán)藥材樣品 (陜西平利-1)，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.5”項(xiàng)下方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h后測定吸光度，依次為0.461、0.454、0.467、0.457、0.452、0.463，RSD為1.24%，表明絞股藍(lán)藥材樣品溶液在2.5h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批絞股藍(lán)藥材樣品(陜西平利-1)5份，每份1.5g，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照“2.1.5”項(xiàng)下方法在同一波長下分別測定吸光度，并代入回歸方程計算樣品中總皂苷含量，分別為4.13%、4.09%、4.16%、4.18%、4.06%，平均含量為4.12%，RSD為1.18%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的絞股藍(lán)藥材樣品 (陜西平利-1) 6份，每份0.75g，精密稱定，每份分別精密加入一定量的人參皂苷Re對照品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.5”項(xiàng)下方法測定吸光度，計算回收率 (以人參皂苷Re計)。結(jié)果表明人參皂苷Re平均回收率為97.79%，RSD為1.44%，表明該方法回收率良好，見表2。

表2 人參皂苷Re回收率測定結(jié)果

2.1.10 樣品中總皂苷含量測定 分別取各產(chǎn)地藥材1.5g，精密稱定，平行2份，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.5”項(xiàng)下方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在同一條件下分別測定吸光度，計算各產(chǎn)地絞股藍(lán)總皂苷含量，結(jié)果見表3。

表3 絞股藍(lán)藥材中總皂苷含量測定結(jié)果 (n=2)

2.2 總多糖含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 取干燥至恒重的D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水溶解制成濃度為0.099mg·mL-1的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取絞股藍(lán)藥材干燥粉末(過四號篩)約1.0g，精密稱定，置于索氏提取器中，加95%乙醇適量，加熱回流至提取液無色，過濾，揮干乙醇，藥渣移入具塞錐形瓶中，精密加入50mL 蒸餾水，回流提取2次，每次1.0h，過濾，合并濾液，加適量95%乙醇沉淀多糖使醇沉濃度達(dá)到75%，4℃下靜置12h，離心15min(3 500r/min)，沉淀加水溶解并轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 最大吸收波長確定 將顯色后的對照品和供試品溶液于200～700nm 波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明對照品和供試品在490nm附近均有最大吸收。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定 精密吸取D-無水葡萄糖對照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分別置于10mL具塞試管中，加水定容至2.0mL，再分別加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加入硫酸5.0mL，搖勻，放置10min，置于40℃水浴中加熱15min，取出迅速冷卻至室溫。以空白溶劑校正零點(diǎn)，于490nm波長處測定其吸光度。以吸光度( A) 為縱坐標(biāo)Y，對照品量(mg) 為橫坐標(biāo)X 進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程為：Y=7.171 7X+0.0164，R2=0.999 4(n=5)。結(jié)果表明，總多糖在0.0198～0.099mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份D-無水葡萄糖對照品溶液，按照“2.2.5”項(xiàng)下方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在同一條件下連續(xù)測定5次吸光度，分別為0.295、0.291、0.302、0.297、0.294，RSD為1.38%，表明該方法精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取絞股藍(lán)藥材樣品 (陜西平利-1)，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.5”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h測定吸光度，分別為0.391、0.378、0.381、0.386、0.395、0.379，RSD為1.79%，表明絞股藍(lán)樣品溶液在2.5h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批絞股藍(lán)藥材樣品 (陜西平利-1) 5份，每份1.0g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.5”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，在同一條件下分別測定吸光度，并代入回歸方程計算樣品中總多糖含量分別為1.96%、1.92%、1.99%、1.89%、1.92%，平均含量為1.94%，RSD為1.91%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的絞股藍(lán)藥材樣品 (陜西平利-1) 6份，每份0.5g，精密稱定，每份分別精密加入一定量的D-無水葡萄糖對照品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.5”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，在同一條件下分別測定吸光度，計算回收率。結(jié)果表明D-無水葡萄糖平均回收率為99.58%，RSD為1.35%，表明該方法回收率良好，見表4。

2.2.10 樣品中總多糖含量測定 分別取各產(chǎn)地藥材1.0g，精密稱定，平行2份，按照“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按照“2.2.5”項(xiàng)下方法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，在同一條件下分別測定吸光度，計算各產(chǎn)地絞股藍(lán)總多糖含量，結(jié)果見表3。

2.3 不同產(chǎn)地間絞股藍(lán)總皂苷和總多糖含量比較

將收集到的絞股藍(lán)樣品以品種為分類依據(jù)，分別對5個產(chǎn)地七葉絞股藍(lán)樣本和5個產(chǎn)地五葉絞股藍(lán)樣本中的總皂苷和總多糖含量進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，七葉絞股藍(lán)5個產(chǎn)地樣本 (陜西平利-1、湖北十堰、湖北神農(nóng)架、廣西桂林、福建古田) 中總皂苷和總多糖含量差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表5；五葉絞股藍(lán)5個產(chǎn)地樣本 (陜西平利-2、陜西平利-3、陜西平利-4、云南昆明、安徽亳州) 中總皂苷和總多糖含量差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表6。

表4 D-無水葡萄糖回收率測定結(jié)果

表5 5個產(chǎn)地七葉絞股藍(lán)樣品總皂苷、總多糖含量比較 (±s，n=10)

表6 5個產(chǎn)地五葉絞股藍(lán)樣品總皂苷、總多糖含量比較 (±s，n=10)

將收集到的絞股藍(lán)樣品以品種為依據(jù)分為七葉絞股藍(lán)組和五葉絞股藍(lán)組，進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，七葉絞股藍(lán)組所含總皂苷含量明顯高于五葉絞股藍(lán)組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表7；五葉絞股藍(lán)組所含總多糖含量稍高于七葉絞股藍(lán)組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表8。

表7 七葉絞股藍(lán)和五葉絞股藍(lán)總皂苷平均含量比較 (±s，n=10)

表8 七葉絞股藍(lán)和五葉絞股藍(lán)總多糖平均含量比較 (±s，n=10)

3 討論

10個不同產(chǎn)地的絞股藍(lán)總皂苷含量在0.34%～7.99%之間，10個不同產(chǎn)地絞股藍(lán)總多糖含量在1.56%～3.82% 之間，且不同產(chǎn)地絞股藍(lán)總皂苷和總多糖含量差異較大，可能是由于絞股藍(lán)生長受到溫度、濕度、土質(zhì)、光照等生長環(huán)境因素影響所致。

七葉絞股藍(lán)總皂苷平均含量(6.11%)明顯高于五葉絞股藍(lán)(0.58%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示絞股藍(lán)皂苷含量與品種存在相關(guān)性；五葉絞股藍(lán)總多糖平均含量(2.62%)稍高于七葉絞股藍(lán)(2.35%)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示絞股藍(lán)多糖含量與品種無相關(guān)性。

在總皂苷含量測定實(shí)驗(yàn)中，考慮到絞股藍(lán)藥材中脂溶性成分對紫外測定干擾較大，故先用石油醚進(jìn)行脫脂處理，除去部分脂溶性成分，減少其在紫外測定中的干擾。

在總多糖含量測定實(shí)驗(yàn)中，考慮到絞股藍(lán)中含有大量皂苷成分，故在提取過程中先用95%乙醇回流處理，不僅能除去大部分皂苷，還能除去一部分單糖、寡糖等小分子物質(zhì)，有利于多糖的提取、純化。

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Study on the Total Saponins and Polysaccharides Content inGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino from Different Producing Areas and Different Varieties

Peng Liang1,Li Yiguang1,2*,Chen Jie1,Rao Yi1,Ji Qiaoyu1,Wei Huizhen1

(1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006,China; 2.Jiangzhong Pharmaceutical Corporation, Nanchang 330096,China)

Objective:Take the content of total saponins and polysaccharides as index, to establish a method for assaying the saponins and polysaccharides, to compare the diversity of total saponins and polysaccharides content inGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino from different producing areas and different varieties, to provide basis for the study of its internal quality.Methods:The UV spectrophotometry was used to determine the contents of total saponins and polysaccharides. The detection wavelength are 550nm and 490nm respectively. The reference substance are Ginsenosides Re and D-Glucose.Results:Good linear relationship with absorbability occurred when Ginsenosides Re in the range of 0.097 8～0.498mg (R2=0.999 8), and the average recovery was 97.79% (RSD=1.44%, n=6). Good linear relationship with absorbability occurred when D-Glucose in the range of 0.019 8～0.099mg (R2=0.999 4), and the average recovery was 99.58% (RSD=1.35%, n=6).Conclusion:The established method is simple, accurate and can be used for the determination of total saponins and polysaccharides. The total saponins content exist differences inGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino from different producing areas and different varieties. The total polysaccharides content exist differences in Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino from different producing areas, but the content of total polysaccharides have no correlation with varieties. The results can able to provide reference for quality control of Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino and related product development research.

Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino;Total Saponins;Total Polysaccharides;Extraction;Content Determination

2015-05-07

彭亮(1990-)，男，江西中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。

李詒光(1974-)，男，博士，江中藥業(yè)股份有限公司主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量評價與開發(fā)。E-mail:lyg@jzjt.com

R284.1

A

1673-2197(2015)22-0021-04

10.11954/ytctyy.201522009