孫璠璠 李 萍 朱志杰 王雨辰 張 月 盧澤原 于曉風(fēng) 睢大筼

(1 吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室,長(zhǎng)春,132001; 2 通化金馬藥業(yè)集團(tuán),通化,134000)

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實(shí)驗(yàn)研究

風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用及機(jī)制

孫璠璠1李 萍2朱志杰2王雨辰1張 月1盧澤原1于曉風(fēng)1睢大筼1

(1 吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室,長(zhǎng)春,132001; 2 通化金馬藥業(yè)集團(tuán),通化,134000)

目的:研究風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)的治療作用及其可能機(jī)制。方法:Wistar大鼠72只,雄性,體重180～220 g,按體重隨機(jī)分為以下6組:正常組,AA模型組,風(fēng)濕祛痛膠囊低、中、高劑量(0.25、0.5、1.0 g/kg)組,萬(wàn)通筋骨片陽(yáng)性藥(0.3 g/kg)組。除正常組外,各組大鼠于右后足跖皮下注射0.1 mL弗氏完全佐劑(FCA)制備AA模型。致炎后第2天開始給藥,每天灌胃給藥1次,連續(xù)21 d。測(cè)定致炎前及致炎后第2、5、8、12、15、18、21、23 d各大鼠致炎足及對(duì)側(cè)足的足跖容積;測(cè)定大鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PMφ)吞噬功能;檢測(cè)血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)及白細(xì)胞介素6(IL-6)的含量;測(cè)定關(guān)節(jié)滲出液中前列腺素E2(PGE2)的含量;測(cè)定血液流變學(xué)變化情況。結(jié)果:風(fēng)濕祛痛膠囊能夠顯著抑制大鼠原發(fā)及繼發(fā)性足跖腫脹,對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能、紅細(xì)胞壓積及血沉有明顯的抑制作用,能夠顯著增強(qiáng)血清中SOD活性,降低血清中MDA、NO、TNF-α、IL-1β及IL-6的含量;明顯降低關(guān)節(jié)滲出液中PGE2的含量。結(jié)論:風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎有顯著的改善作用,其機(jī)制可能與抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能、增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力、降低血清中的炎性反應(yīng)因子水平及改善血液流變學(xué)有關(guān)。

風(fēng)濕祛痛膠囊;佐劑性關(guān)節(jié)炎;大鼠;自由基;炎性反應(yīng)因子

風(fēng)濕祛痛膠囊是由川黃柏、蒼術(shù)、威靈仙等19味中藥組成的復(fù)方制劑,具有燥濕祛風(fēng),活血化瘀,通絡(luò)止痛功能。用于痹病寒熱錯(cuò)雜證,癥見肌肉關(guān)節(jié)疼痛,腫脹,關(guān)節(jié)活動(dòng)受限,晨僵,局部發(fā)熱,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎見上述證候者。君藥黃柏為蕓香科植物黃皮樹的干燥樹皮,其苦寒沉降,清熱燥濕,瀉火解毒能力強(qiáng),歸腎、膀胱經(jīng)。現(xiàn)代研究表明[1],黃柏具有抗菌、抗炎、解熱、抗癌等多種藥理作用,在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用和開發(fā)前景。蒼術(shù)為菊科蒼術(shù)屬植物,具有化濕運(yùn)脾作用,用于燥濕健脾,散寒祛風(fēng),風(fēng)濕痹痛及夜盲等病癥[2]。威靈仙為毛茛科植物,根部入藥用于祛風(fēng)濕,通經(jīng)絡(luò),消痰涎,散癖積,對(duì)全身游走性風(fēng)濕痛尤其適宜[3]。雞血藤,為五味子科、菟絲子科、大血藤科、蝶形花科等多種植物的別稱,常與地龍、黃芪、當(dāng)歸、丹參等配伍,用于治療風(fēng)濕所致的腰膝關(guān)節(jié)疼痛、風(fēng)濕痹痛、肢體麻木[4]等。目前尚未見風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎治療作用的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。本文通過(guò)建立AA模型,觀察風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用及潛在機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 主要試劑 風(fēng)濕祛痛膠囊,由通化金馬藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供,批號(hào):20140601;萬(wàn)通筋骨片,規(guī)格:0.28 g/片,由通化萬(wàn)通藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),批號(hào):140509H;佐劑用卡介苗,規(guī)格:60 mg/支,由中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn),批號(hào):201301;SOD、NO測(cè)定試劑盒,由南京建成生物研究所提供,生產(chǎn)批號(hào):20140909;MDA測(cè)試盒,由南京建成生物研究所生產(chǎn),批號(hào):20140915;IL-1β、TNF、IL-6測(cè)定試劑盒,由北京康源瑞德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),批號(hào):20140925。

1.2 大鼠AA模型的建立 制備FCA[5]:取10 mL熔化的無(wú)水羊毛脂與20 mL液體石蠟混合后共研磨1 h,經(jīng)30 min高壓滅菌后即得弗氏不完全佐劑(FIA),置于4 ℃保存?zhèn)溆?。臨用前取10.5 mLFIA于研缽中,將180 mg卡介苗(4.5 mL注射用水溶解)緩慢勻速滴入研缽,邊研邊滴,按同一方向與FIA共研磨約1.5 h,即制為弗氏完全佐劑,備用。正常組大鼠不做任何處理,其余大鼠于右后足跖皮下注射FCA 0.1 mL制備AA模型[6]。

1.3 動(dòng)物分組及給藥 雄性Wistar大鼠72只,體重180～200 g,按體重隨機(jī)分為6組:正常(0.5%羧甲基纖維素鈉10 mL/kg)組,模型(0.5%羧甲基纖維素鈉10 mL/kg)組,風(fēng)濕祛痛膠囊低、中、高劑量(0.25、0.5、1.0 g/kg)組,萬(wàn)通筋骨片陽(yáng)性藥(0.3 g/kg)組。造模后第2天開始灌胃給藥,1次/d,連續(xù)21 d。

1.4 測(cè)定足跖腫脹程度 于造模前及造模后第2、5、8、12、15、18、21、23 d測(cè)定大鼠左、右足跖容積,計(jì)算足跖腫脹率[7]。足跖腫脹率(%)=(致炎前足容積-致炎前足容積)/致炎前足容積×100%

1.5 測(cè)定腹腔巨噬細(xì)胞(PMφ)吞噬功能 造模后第24天,用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,消毒腹部皮膚后向腹腔內(nèi)注射15 mL含肝素預(yù)冷PBS灌洗,取8 mL腹腔液,離心(1 500 r/min,10 min)后棄上清,用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次后將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至2.5×106/mL,以100 μL/孔加到96孔板中于培養(yǎng)箱孵育24 h,棄去上清液后以每孔100 μL加入0.075%中性紅染液,孵育15 min后棄去上清,溫PBS洗2次細(xì)胞,加巨噬細(xì)胞裂解液作用于4 ℃過(guò)夜。波長(zhǎng)530 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度[8]。

1.6 測(cè)定血液流變學(xué)指標(biāo) 取1 mL已抗凝血加入壓積管中,放置離心機(jī)3 500 r/min離心30 min,計(jì)算紅細(xì)胞壓積。另取已抗凝血1.5 mL測(cè)定1 h、2 h血沉率。

1.7 測(cè)定相關(guān)生化指標(biāo) 取血于室溫靜置后離心(2 000 r/min,10 min),分離血清于-80 ℃下保存?zhèn)溆?。用生化試劑盒測(cè)定SOD活性,MDA及NO含量;用放射性免疫分析測(cè)定盒測(cè)定TNF-α、IL-1β及IL-6含量[9]。

1.8 關(guān)節(jié)浸出液中PGE2的含量測(cè)定 大鼠炎性腫脹足剪碎后浸泡于5 mL生理鹽水中約1 h后離心(2 500 r/min,10 min),取上清液0.3 mL,加2 Ml KOH-甲醇溶液(0.5 mmoL/L)于50 ℃下作用20 min,用甲醇將溶液體積加至20 mL。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(波長(zhǎng)278 nm)。PGE2的含量表示為每克炎性組織的吸光度值[10]。

2 結(jié)果

2.1 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)足跖腫脹程度的影響 模型組大鼠左、右足腫脹率均顯著增高,與正常組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01～P<0.001)。風(fēng)濕祛痛膠囊0.5 g/kg、1.0 g/kg于給藥后第6、10、13、16、19、21 d均可使大鼠右側(cè)足腫脹顯著降低,與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),0.25 g/kg于給藥后第21 d可顯著降低右側(cè)足腫脹(P<0.05);風(fēng)濕祛痛膠囊1.0 g/kg于給藥后第10、13、16、19、21 d顯著降低左側(cè)足腫脹(P<0.05),0.5 g/kg于給藥后第16、19、21 d顯著降低左側(cè)足腫脹(P<0.05),0.25 g/kg劑量對(duì)左側(cè)足腫脹無(wú)顯著影響(P>0.05),見表1、表2。

表1 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)右側(cè)原發(fā)性足腫脹的影響

注:與正常組相比，△P<0.001;與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

表2 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)左側(cè)繼發(fā)性足腫脹的影響

注:與正常組比較，△P<0.01，△△P<0.001;與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

表3 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)血清MDA含量及SOD活性的影響

注:與正常組比較，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)巨噬細(xì)胞噬功能的影響 模型組巨噬細(xì)胞吞噬功能明顯增強(qiáng),與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),風(fēng)濕祛痛膠囊0.25、0.5、1.0 g/kg均可使巨噬細(xì)胞吞噬功能明顯降低,與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與陽(yáng)性藥萬(wàn)通筋骨片作用強(qiáng)度相似,見圖1。

圖1 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

注:與正常組比較，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05

2.3 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)PGE2在關(guān)節(jié)滲出液的含量影響 模型組大鼠關(guān)節(jié)滲出液中PGE2含量顯著升高,與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),風(fēng)濕祛痛膠囊0.5、1.0 g/kg可顯著降低PGE2含量,與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),0.25 g/kg對(duì)PGE2含量無(wú)明顯影響(P>0.05),見圖2。

圖2 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)關(guān)節(jié)滲出液中PGE2含量的影響

注：與正常組比較，#P<0.01;與模型組比較，*P<0.05

2.4 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)血液流變學(xué)的影響 模型組紅細(xì)胞壓積及血沉均顯著升高,與正常比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),風(fēng)濕祛痛膠囊1.0 g/kg能顯著抑制紅細(xì)胞壓積,并使1 h及2 h血沉顯著下降,與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),0.5 g/kg劑量能夠顯著降低1h血沉,但對(duì)紅細(xì)胞壓積及2 h血沉均無(wú)顯著影響,0.25 g/kg對(duì)紅細(xì)胞壓積及1 h、2 h血沉均無(wú)明顯影響(P>0.05),圖3及圖4。

表4 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)血清NO、IL-1β、TNF-α及IL-6含量的影響

2.5 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)血清MDA含量及SOD活性的影響 模型組血清MDA含量明顯增加,SOD活性明顯降低,與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),風(fēng)濕祛痛膠囊0.5、1.0 g/kg均可明顯降低血清中MDA含量,升高SOD活性,且與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),0.25 g/kg可使SOD活性升高(P<0.05),但對(duì)MDA含量無(wú)明顯影響(P>0.05),見表3。

圖3 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)紅細(xì)胞壓積的影響

注：與正常組比較，#P<0.05;與模型組比較，*P<0.05

圖4 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)血沉的影響

注：與正常組比較，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05

2.6 風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)血清NO、IL-1β、TNF-α及IL-6含量影響 模型組血清NO、IL-1β、TNF-α及IL-6含量均明顯增加,與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.01),相比于模型組,風(fēng)濕祛痛膠囊1.0 g/kg可使血清NO、IL-1β、TNF-α及IL-6的含量顯著升高(P<0.05或P<0.01),0.5 g/kg可明顯降低血清中IL-1β、TNF-α的含量(P<0.01),但對(duì)NO、IL-6均無(wú)明顯影響(P>0.05);0.25 g/kg可明顯降低血清中TNF-α的含量(P<0.05),對(duì)NO、IL-1β、IL-6均無(wú)明顯影響(P>0.05)。見表4。

3 討論

大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant Arthritis,AA)模型在臨床表現(xiàn)、病理學(xué)、免疫學(xué)改變和病理機(jī)制等方面與人風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有許多相似特征,是研究風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理機(jī)制和評(píng)價(jià)治療該疾病藥物的較理想動(dòng)物模型[6]。本研究通過(guò)建立大鼠AA模型,詳細(xì)描述了大鼠AA模型的炎性反應(yīng)表現(xiàn)特征,以及對(duì)與疾病過(guò)程相關(guān)因子進(jìn)行了測(cè)定。

風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見的慢性、復(fù)發(fā)性的自身免疫性疾病,常表現(xiàn)為滑膜組織增生,血管生成,軟骨損毀,骨破壞及關(guān)節(jié)功能性殘疾。這種系統(tǒng)性疾病是由關(guān)節(jié)組織持續(xù)發(fā)炎引起的,進(jìn)而產(chǎn)生疼痛、僵硬、腫脹及其他多種癥狀[11]。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在全世界范圍內(nèi)普遍流行,導(dǎo)致長(zhǎng)期殘疾甚至過(guò)早死亡,嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量。因此,繼續(xù)對(duì)該病進(jìn)行病理生理性及藥理學(xué)研究,尋找新型治療藥物顯得尤為重要。通常情況下,臨床上治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎采用非甾體類的化學(xué)合成藥物,例如布洛芬,醋氯芬酸及萘普生,同時(shí)配合甾體類激素如可的松和潑尼松。然而,這些藥物僅能暫時(shí)緩解炎性反應(yīng),減輕癥狀,對(duì)疾病的長(zhǎng)期治療效果并不明顯[12]。而且,在疾病的治療過(guò)程中,由于嚴(yán)重的不良反應(yīng)如胃腸道潰瘍、心血管并發(fā)癥、血液毒性及腎衰竭等的影響,許多患者對(duì)藥物不再產(chǎn)生任何反應(yīng)或者不得不被強(qiáng)制終止治療,因此,采用這類藥物治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成效是極有限的[13]。由于這些藥物的治療缺點(diǎn),尋找新的高效、低毒抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物成為亟待解決的難題。本研究采用大鼠AA模型,研究風(fēng)濕祛痛膠囊治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的效果及病理機(jī)制,結(jié)果表明,風(fēng)濕祛痛膠囊能使大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腫脹程度,顯著抑制腹腔巨噬細(xì)胞的活化,降低紅細(xì)胞壓積及血沉,顯著降低關(guān)節(jié)滲出液中PGE2含量,能夠使血清中MDA、NO、IL-1β、IL-6及TNF-α含量顯著降低,顯著升高血清SOD活性。

本試驗(yàn)證明,風(fēng)濕祛痛膠囊具有良好的抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用,該作用機(jī)制主要與其能夠抑制巨噬細(xì)胞活化,降低血清中的炎性因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等的含量,提高機(jī)體清除氧自由基的能力以及改善機(jī)體血液流變學(xué)性質(zhì)等因素有關(guān)。

[1]張冠英,董瑞娟,廉蓮.川黃柏、關(guān)黃柏化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,29(10):812-821.

[2]付紅梅,朱東海,方婧,等.蒼術(shù)的化學(xué)、分子生藥學(xué)和藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2009,34(20):2669-2672.

[3]章蘊(yùn)毅,張宏偉,李佩芬,等.威仙靈的解痙抗炎鎮(zhèn)痛作用[J].中成藥,2001,23(11):808-811.

[4]符影,程悅,陳建萍,等.雞血藤化學(xué)成分及藥理作用研究[J].中草藥,2011,42(6):1229-1234.

[5]馮芳,丁志建,劉俊.佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].天津藥學(xué),2004,16(2):1-4.

[6]李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].2版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2006:749-751.

[7]李培培,解國(guó)雄,宋珊珊,等.大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型表現(xiàn)特征及評(píng)價(jià)指標(biāo)[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2012,28(5):453-457.

[8]曾陽(yáng),馬繼雄,鮑敏,等.藏藥翁布總苷對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2010,15(12):1321-1325.

[9]高俊,丁真奇.細(xì)胞因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中作用的研究現(xiàn)狀[J].醫(yī)學(xué)綜述,2006,12(5):289-291.

[10]付雯雯.烏頭注射液對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用及其機(jī)制[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué),2013.

[11]Lingling Shen,Pingtao Wang,Junhao Guo,et al.Anti-arthritic activity of ethanol extract of Fagopyrum cymosum with adjuvant-induced arthritis in rats[J].Pharmaceutical Biology,2013,51(6):783-789.

[12]Xin-xin Zhang,Yoichiro Ito,Jin-ru Liang,et al.Therapeutic effects of total steroid saponin extracts from the rhizome of Dioscorea zingiberensis C.H.Wright in Freund's complete adjuvant induced arthritis in rats[J].International Immunopharmacology,2014(23):407-416.

[13]Ke Pan,Xiao Xia,Wen-Hua Guo,et al.Suppressive effects of total alkaloids of Lycopodiastrum casuarinoides on adjuvant-induced arthritis in rats[J].Journal of Ethnopharmacology,2015(195):17-22.

(2015-08-31收稿 責(zé)任編輯：王明)

Efficacy and Mechanism of Fengshi Qutong Capsule on Adjuvant Arthritis Rats

Sun Fanfan1, Li Ping2, Zhu Zhijie2, Wang Yuchen1, Zhang Yue1, Lu Zeyuan1, Yu Xiaofeng1, Sui Dayun1

(1DepartmentofPharmacology,SchoolofPharmacy,JilinUniversity,Changchun130021，China; 2TongHuaGolden-horseGroup,TongHua134000，China)

Objective:To observe the efficacy of Fengshi Qutong Capsule on adjuvant-induced arthritis (AA) rats and its possible mechanism.Methods:Male Wistar rats (weighing 180～220 g), with the amount of 72, were divided into six groups randomly: control group, AA group, low, medium, high doses (0.25, 0.5, 1.0 g/kg) of Fengshi Qutong Capsule groups as well as Wantong Jingu Pill (0.3 g/kg) positive control group. Except for the control group, the arthritis was induced by a single injection of 0.1 mL of Freund`s complete adjuvant(FCA) into the palmer subcutaneous tissue of the right hind paw. The second day after the onset of arthritis, all the rats were administrated by drugs once per day for 21 days. The swelling symptom of both hind paws on second, 5th, 8th, 12th, 15th, 18th, 21st, 23rd days were examined; arthritis indexes of non-injected paws were assessed; PMφ function was evaluated; the activity of SOD and the contents of MDA, NO, TNF-α, IL-1β, IL-6 in serum were measured as well as the content of PGE2in tissue fluid and the hemorheology changes.Results:The swelling symptom in right hind paw and left hind paw were significantly relieved among the Fengshi Qutong Capsule groups, the function of PMφ, the hematocrit and erythrocyte sedimentation rate declined significantly; the SOD activity increased while the contents of MDA, NO, TNF-α, IL-1β, IL-6 in serum significantly decreased; and Fengshi Qutong Capsule can also significantly help decrease the content of PGE2in inflammatory tissue fluid. Conclusion:Fengshi Qutong Capsule shows satisfactory therapeutic effects on AA rats, its mechanism may be related to the inhibition of PMφ activation, enhancement of the capability of scavenging free radicals, declination of inflammatory elements' levels and the improvement of the changes of hemorheology.

Fengshi Qutong Capsule; Adjuvant arthiritis; Rats; Free radicals; Inflammatory factors

吉林省創(chuàng)新型科技企業(yè)項(xiàng)目(編號(hào):20130306048HJ)

睢大筼(1957—),男,吉林長(zhǎng)春人,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事心血管藥理研究,Tel：(0431)85619705，E-mail：suidy@jlu.edu.cn

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.12.025