王秋紅 楊 欣 李雪磊 楊炳友 王艷宏 匡海學(xué)

(教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)

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基于蛋白質(zhì)組學(xué)的附子、干姜和花椒的性味研究

王秋紅 楊 欣 李雪磊 楊炳友 王艷宏 匡海學(xué)

(教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)

目的：探討溫?zé)嶂兴?附子、干姜、花椒)對正常大鼠能量代謝及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探索溫?zé)嶂兴幵谛晕丁πА幚碜饔蒙系墓残院筒町愋?，為闡明溫?zé)嶂兴幮晕兜目茖W(xué)內(nèi)涵提供依據(jù)。方法：選擇Sprague Dawley(SD)雌雄大鼠，給藥21 d后，大鼠通過腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉麻醉(每100 g體重0.15 mL)，差速離心法提取蛋白，BCA蛋白定量和SDS-PAGE檢測蛋白完整性，應(yīng)用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)結(jié)合2D LC-MS/MS篩選肝臟中的差異蛋白。結(jié)果：與空白對照組相比，溫?zé)嶂兴?附子、干姜、花椒)共篩選出50個(gè)共有差異蛋白，其中11個(gè)差異蛋白在肝臟中低表達(dá)，39個(gè)差異蛋白在肝臟中高表達(dá)，50個(gè)共有差異蛋白主要分布在18個(gè)通路中，其中絕大多數(shù)與能量代謝相關(guān)。結(jié)論：附子、干姜、花椒等熱性中藥在蛋白質(zhì)組學(xué)方面存在共性和差異性，這種共性不僅體現(xiàn)在物質(zhì)代謝和能量代謝上，也體現(xiàn)在其他藥理作用上，其中，主要是通過增加體內(nèi)熱量生成和提高對能量的利用兩個(gè)方面影響機(jī)體的能量代謝。研究結(jié)果為以“中藥同時(shí)具有性(氣)與味，性(氣)與味是中藥(包括方劑、單味中藥、有效部位或組分、單體化合物)同時(shí)兼具的兩種特性。藥味與藥物的具體功效相關(guān)。藥性(氣)是藥物通過不同途徑以主要影響機(jī)體的能量代謝、物質(zhì)代謝為特征的，可影響藥物療效發(fā)揮或與副作用發(fā)生有關(guān)的一類生物學(xué)效應(yīng)。”的中藥性味理論新假說的客觀性提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為評價(jià)中藥寒熱藥性提供了新的方法。

附子；干姜；花椒；中藥性味；寒熱藥性；能量代謝；藥理作用；蛋白質(zhì)組學(xué)

中藥藥性理論研究，特別是中藥四性科學(xué)內(nèi)涵的解析是目前中醫(yī)藥研究難點(diǎn)和重點(diǎn)領(lǐng)域。中藥具有的四性(氣)，即寒、熱、溫、涼是中藥的基本特性。中藥四性中的溫和熱，寒和涼在本質(zhì)上并沒有差別，只是程度上有所不同。中醫(yī)認(rèn)為的寒熱藥性是根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)和反復(fù)驗(yàn)證歸納總結(jié)所得，是對藥物療效作用的高度概括，臨床上運(yùn)用藥物四氣治療疾病，主要是根據(jù)藥物的寒、熱、溫、涼之偏性，治療疾病的寒和熱，從而使人體達(dá)到相對平衡狀態(tài)[1-4]。西藥雖然具有物質(zhì)結(jié)構(gòu)明確、作用機(jī)理清晰的優(yōu)勢，卻由于沒有標(biāo)示其寒熱藥性，因此不能向中藥一樣在臨床上辨證用藥，因此，中藥的四性也是中藥有別于西藥的最本質(zhì)的特征。迄今，諸多不同學(xué)科的研究者應(yīng)用各種不同的研究方法，從機(jī)體功能的多個(gè)方面如神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、能量代謝等，對中藥四性開展了大量的探索性研究，盡管證實(shí)一些溫?zé)崴幙梢蕴岣邫C(jī)體的基礎(chǔ)代謝率，或?qū)?nèi)分泌系統(tǒng)、中樞和植物神經(jīng)系統(tǒng)有興奮作用[5-7]，但是仍還沒有建立完整的體系詮釋全部中藥的寒熱藥性的科學(xué)內(nèi)涵。在中藥四性的研究方法方面，國內(nèi)研究者雖然采用了諸多現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)前沿的研究方法，但還沒有建立起適于中藥復(fù)雜體系與特點(diǎn)的、能對藥性、藥味的科學(xué)內(nèi)涵進(jìn)行科學(xué)解析的有效途徑及方法[8-10]。

本課題組匡海學(xué)教授提出了中藥性(氣)味科學(xué)內(nèi)涵的新假說，即“中藥同時(shí)具有性(氣)與味，性(氣)與味是中藥(包括方劑、單味中藥、有效部位或組分、單體化合物)同時(shí)兼具的兩種特性。藥味與藥物的具體功效相關(guān)。藥性(氣)是藥物通過不同途徑以主要影響機(jī)體的能量代謝、物質(zhì)代謝為特征的，可影響藥物療效發(fā)揮或與副作用發(fā)生有關(guān)的一類生物學(xué)效應(yīng)。促進(jìn)機(jī)體能量代謝、物質(zhì)代謝的中藥具有熱(或溫)性，抑制機(jī)體能量代謝、物質(zhì)代謝的中藥具有寒(或涼)性。藥性(氣)可以通過動物實(shí)驗(yàn)以及系統(tǒng)生物學(xué)等方法予以評價(jià)歸屬。中藥一味一性，一藥內(nèi)部X味Y性(Y≤X)”。本文依據(jù)匡海學(xué)教授的這個(gè)科學(xué)假說，并采用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，選擇代表性的溫?zé)嶂兴幐阶印⒏山突ń?，在蛋白質(zhì)水平上開展藥性、藥味的實(shí)驗(yàn)研究，探討溫?zé)嶂兴幵谒幮院退幬吨写嬖诠残院筒町愋裕瑸檫M(jìn)一步驗(yàn)證匡海學(xué)教授提出的中藥藥性科學(xué)內(nèi)涵新假說的客觀性提供依據(jù)，也為完善中藥寒熱藥性的評價(jià)方法進(jìn)行有益的探索。

1 材料與動物處理

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 所選用的附子、干姜、花椒購買于哈爾濱世一堂藥店，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室都曉偉教授鑒定符合2010版《中華人民共和國藥典》相關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 iTRAQ? Reagents Multiplex Kit(Applied Biosystem)；iTRAQ? Reagents Application Kit-Plasma(Applied Biosystem)；乙腈(Fisher Scientific)；甲醇(Fisher Scientific)；BCA Protein Assay Kit(康為世紀(jì))；組織蛋白提取試劑盒(康為世紀(jì))；SDS凝膠試劑盒(康為世紀(jì))；考馬斯亮藍(lán)染料G250(Amesco)；雙蒸水為本實(shí)驗(yàn)室用MilliQ純水儀制備；乙醇(Fisher Scientific)；甲酸(Fisher Scientific)；胰蛋白酶(Promega)；Durashell-C18(Agela)；10K超濾管(100個(gè)/Pack，Sartorious)；strata-X C18除鹽柱(phenomenex)；進(jìn)樣瓶(Agilent，5183-2072)；瓶蓋(Agilent，5185-5829)；內(nèi)稱管(Agilent，5182-0549)；噴針(New Objective，PN：FS360-20-10-N-20-C12)。

1.3 中藥水煎液的制備 按臨床常用方法對藥物進(jìn)行處理。稱取定量的上述藥材，加入10倍量水，浸泡60 min，快速加熱至沸騰，煎煮60 min，傾出藥液，殘?jiān)偌尤?倍水，煎煮提取60 min。合并2次藥液，濾過，附子、干姜、花椒分別濃縮至含生藥量為0.53 g/mL、0.42 g/mL、0.20 g/mL的中藥水提液，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥 雌性SD大鼠40只，體重(180±20) g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：SCXK黑2014007，置動物籠飼養(yǎng)，保持室內(nèi)溫度18～22 ℃，室內(nèi)晝夜自然明暗交替照明，飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料。將大鼠隨機(jī)分為4組，空白對照組、附子組、干姜組和花椒組，每組各10只。大鼠在動物飼養(yǎng)室適應(yīng)7 d后，各給藥組劑量均為臨床人用高限劑量的42倍，每天分別按給藥容積為20 mL/kg體重連續(xù)灌胃生理鹽水和附子(10.5 g/kg)、干姜(8.4 g/kg)、花椒(4.0 g/kg)水煎液21 d，各組飼養(yǎng)過程中保持溫度、光照、濕度等環(huán)境條件均衡，自由進(jìn)食飲水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品處理 給藥21 d后，大鼠通過腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉麻醉(每100 g體重0.15 mL)，迅速打開腹腔，從門靜脈注射冰冷的生理鹽水，清除殘留血液，取出肝臟，用冰冷緩沖液洗凈，去除肝臟表面的血液，用濾紙吸干表面液體，稱重。蛋白提取采用組織蛋白抽提試劑盒(康為世紀(jì)：CW0891)，取0.1 g大鼠肝臟組織，用液氮研磨能細(xì)末，轉(zhuǎn)入離心管中；取990 L的蛋白抽提試劑，加入10 L的蛋白酶抑制劑，蛋白酶抑制混合物在進(jìn)行蛋白抽提前2 min內(nèi)加入；冰上孵育20 min；10 000×g離心20 min；收集上清，在-80 ℃保存?zhèn)溆?。提取的蛋白采用BCA(Bicin-choninic Acid)蛋白定量試劑盒(康為世紀(jì)：CW0014)進(jìn)行蛋白定量，在分光光度計(jì)在562 nm處測定每個(gè)樣品及BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)X軸(縱坐標(biāo))為蛋白的質(zhì)量濃度μg/μL，Y軸(縱坐標(biāo))為吸光值。用excel制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白含量。蛋白完整性采用SDS-PAGE凝膠試劑盒(Beyotime biotechnology，China)，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，凝膠厚度為1 mm，考馬斯亮藍(lán)快速染色(G250)方法進(jìn)行凝膠染色，染色后的凝膠用BIO-RAD掃描儀進(jìn)行掃描，重復(fù)3次，并利用Image Lab 4.0.1軟件進(jìn)行圖像分析。

2.2 樣品酶解實(shí)驗(yàn)步驟 蛋白定量后取100 μg蛋白溶液置于離心管中；加入4 μL Reducing Reagent，37度反應(yīng)1 h；加入2 μL Cysteine-Blocking Reagent，室溫10 min；將還原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超濾管中，12 000轉(zhuǎn)離心20 min，棄掉收集管底部溶液；加入iTRAQ?試劑盒中的Dissolution Buffer 100 μL，12 000轉(zhuǎn)離心20 min，棄掉收集管底部溶液，重復(fù)3次；更換新的收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，總量2～4 μg，37 ℃反應(yīng)過夜；次日，12 000轉(zhuǎn)離心20 min，酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部；在超濾管中加入50 μL Dissolution Buffer，12 000轉(zhuǎn)離心20 min，與上步合并，收集管底部共得到150 μL酶解后的樣品。

2.3 標(biāo)記步驟 從冰箱中取出iTRAQ?試劑，平衡到室溫，將iTRAQ?試劑離心至管底；向每管iTRAQ?試劑中加入200 μL乙醇，渦旋振蕩；取75 μL樣品(100 μg酶解產(chǎn)物)轉(zhuǎn)移到新的離心管中；將iTRAQ?試劑填加到樣品中，空白組：114，附子組：115，干姜組：116，花椒組：117。渦旋振蕩，室溫反應(yīng)2 h；加入100 μL水終止反應(yīng)；混合標(biāo)記后的樣品，渦旋振蕩；真空冷凍離心干燥；抽干后的樣品冷凍保存待用。

2.4 高pH反相分級 流動相A(pH=10 2% ACN，0.1% FA)。流動相B(20 mM Ammonium formate(pH=10),80%ACN)。將標(biāo)記抽干后的樣品用150 μL流動相A復(fù)溶，渦旋振蕩，12 000轉(zhuǎn)離心20 min，吸取上清供檢測，進(jìn)樣量100 μL；準(zhǔn)備46個(gè)空白1.5 mL離心管，依次標(biāo)記為1-46，用于收集分離得到的組份1-46；流速0.8 mL/min；分離梯度為0—6 min，5%B;6—6.1 min,5%～8%B;6.1—30 min,8%～30%B;30—39 min,30%～50%B;39—40 min,50%～80%B;40—44 min,80%B;44—45 min,80～5% B;45—55 min，5%B。從第5 min開始，收集每分鐘的洗脫物依次到1-46號離心管中；真空冷凍離心干燥；抽干后的樣品冷凍保存待用。

2.5 納升級反相色譜-TripleTOFTM 5600進(jìn)行蛋白質(zhì)分析 根據(jù)紫外監(jiān)測情況，將高pH反相分離得到的46個(gè)組分合并為10個(gè)組分，合并時(shí)采用30 μL 2% ACN，0.1% FA，加入第一個(gè)離心管，渦旋振蕩并離心后，轉(zhuǎn)入第二個(gè)離心管，依次直至合并組分最后一管；12 000轉(zhuǎn)離心10 min，吸取上清上樣；上樣體積8 μL，采取夾心法上樣；流動相A(2%ACN+0.1%FA)，流動相B(98%ACN+0.1%FA);Loading Pump流速2 μL/min，15 min,流動相A；gradient1分離流速0.3 μL/min,流動相為A,B;洗脫梯度為0—0.1 min,5%～8%B;0.1—60 min，8%～27%B;60—74.9 min，27%～50%B;74.9—75 min，50%～80% B;75—80 min，80%B;80—80.5 min，80%～5% B;80.5—90 min,5%B。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置：源氣參數(shù)：Ion spray voltage：2.3 kv；GS1：3；Curtain gas：30或35；DP：100或80；TOF MS：m/z：350-1250；accumulation time：0.25 s；product ion scan：IDA mumber：30；m/z：100-1500；accumulation time：0.1 s；Dynamic exclusion time：25 s；Rolling CE：enabled；Adjust CE when using iTRAQ? reagent：enabled；CES：5。

2.6 數(shù)據(jù)庫搜索 采用ProteinPilotTM4.5和DAVID Bioinformatics Resources 6.7鑒定差異蛋白和差異蛋白代謝通路分析。Cytoscape 3.2.0、IntAct[11]和MINT[12]對差異蛋白進(jìn)行蛋白相互作用分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 2D LC-MS/MS定量肝臟共有差異蛋白 采用ProteinPilotTM Software 4.5篩選鑒定出差異蛋白，ProteinPilotTM Software軟件操作簡單，簡化蛋白鑒定和定量的過程，可以同時(shí)鑒定成百上千的肽段修飾和非胰酶的斷裂；方便地區(qū)分蛋白異構(gòu)體、蛋白亞群，抑制蛋白鑒定假陽性結(jié)果；并以可視化方式明確展現(xiàn)肽段—蛋白之間的相互關(guān)聯(lián)。篩選的差異表達(dá)的蛋白需同時(shí)滿足下列條件：在兩次技術(shù)重復(fù)中均被鑒定為差異蛋白質(zhì)；蛋白的鑒定基于兩個(gè)或兩個(gè)以上特異性肽段；蛋白的差異在兩次實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)平均變化比率上調(diào)1.2倍以上或者下調(diào)0.6倍以上。在肝臟中共鑒定出2 047個(gè)蛋白。依據(jù)上述要求，附子、干姜、花椒與空白組比較鑒定出50個(gè)差異蛋白，下調(diào)11個(gè)差異蛋白，上調(diào)39個(gè)差異蛋白。詳見表1。

表1 附子、干姜、花椒與空白對照組比較共有差異蛋白

注：↑：差異蛋白在肝臟中高表達(dá)，↓：差異蛋白在肝臟中低表達(dá)。

3.2 附子、干姜、花椒共有差異蛋白的藥理作用分析 中藥藥性是中醫(yī)基礎(chǔ)理論的核心，藥理作用是藥物發(fā)揮作用效果的高度概括和總結(jié)，藥性和藥理作用相互影響，是將中醫(yī)和西醫(yī)聯(lián)系的有效方法，也是揭示中藥藥性本質(zhì)的有效手段。中藥藥性理論研究的最佳方法是基于中藥藥理作用。研究藥性在藥理作用方面的特性和規(guī)律性，具有一定的典型性和示范性。本研究以中藥藥性、藥效及能量代謝的相關(guān)性為主，將中藥傳統(tǒng)理論與蛋白質(zhì)組學(xué)成果聯(lián)系起來，在蛋白質(zhì)組學(xué)方面建立符合中醫(yī)藥思想的中藥藥性組方體系[13-14]。

附子、干姜、花椒，三者性味皆辛熱，均具有溫里散寒之功，這是主要共同點(diǎn)。綜合現(xiàn)代藥理學(xué)研究報(bào)道可知，附子、干姜、花椒共有的藥理作用包括抗腫瘤、抗衰老、鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝、對心血管系統(tǒng)的作用等[15-17]。本文從附子、干姜、花椒共篩選出50個(gè)共有、且作用趨向一致的差異蛋白，首先采用Uniprot(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫確認(rèn)蛋白功能，并通過網(wǎng)絡(luò)可視化和分析軟件Cytoscape聯(lián)合差異蛋白文獻(xiàn)將差異蛋白進(jìn)行系統(tǒng)地歸納分析。如圖1。

3.2.1 附子、干姜、花椒的抗腫瘤作用 本次研究發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃給予附子、干姜、花椒水煎液后，與抗腫瘤相關(guān)的蛋白谷胱甘肽過氧化物酶l、糖原磷酸化酶、碳酸酐酶1、碳酸酐酶3表達(dá)上調(diào)。目前，GSH-Px至少有4種同工酶，谷胱甘肽過氧化物酶l[18](GPXl)是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)家族中的重要成員之一。廣泛分布于機(jī)體各個(gè)組織，主要功能是將脂質(zhì)過氧化物和過氧化氫催化分解成相應(yīng)的醛類和水，許多研究顯示在動脈粥樣硬化、血管壁抗氧化應(yīng)激和肝癌中GPX1發(fā)揮主要作用。研究表明：GSH-Px在肝癌組織表達(dá)明顯降低。碳酸酐酶[19-20](carbonic anhydrase，CA)廣泛存在哺乳動物中，幾乎各個(gè)組織中都可以檢測到CA的存在，CA機(jī)體的生理過程和物質(zhì)代謝發(fā)揮重要作用，如生理過程的酸堿平衡、骨吸收、唾液和胃酸的形成等，以及物質(zhì)代謝中的尿素生成、糖異生和脂肪生成等。CA與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，隨著腫瘤病理機(jī)制不斷深入的研究，碳酸酐酶與腫瘤的關(guān)系已成為研究的熱點(diǎn)。CA1、CA2、CA3在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。糖原磷酸化酶[21]Glycogen phosphorylase，GP)是糖原代謝過程中的關(guān)鍵酶，在糖原分解反應(yīng)的第一步CP利用無機(jī)磷酸鹽將糖原轉(zhuǎn)化為1-磷酸葡萄糖。主要包括亞型即肌型(Muscle-type GP，PYGM)、肝型(Liver-type GP，PYGL)與腦型(Brain-type GP，BGP或PYGB)三種亞型，PYGL在調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡上發(fā)揮主要作用，在增殖快、分化差的肝癌細(xì)胞系中PYGL的表達(dá)缺失或降低。已有文獻(xiàn)證明附子、干姜、花椒具有抗腫瘤作用[22-24]。本實(shí)驗(yàn)可見附子、干姜、花椒能誘導(dǎo)谷胱甘肽過氧化物酶l、糖原磷酸化酶、碳酸酐酶1、碳酸酐酶3的表達(dá)上調(diào)，與三者均具有抗腫瘤作用相一致，同時(shí)表明這可能是抑制腫瘤作用的分子學(xué)機(jī)制之一。

3.2.2 附子、干姜、花椒的抗衰老作用 細(xì)胞衰老是個(gè)復(fù)雜而漸進(jìn)的過程。它是指細(xì)胞在外在微環(huán)境變化或內(nèi)在特定基因表達(dá)與失活等因素作用下脫離細(xì)胞周期，并不可逆地喪失增殖能力后進(jìn)入的一種相對穩(wěn)定狀態(tài)。引起細(xì)胞衰老的因素很多，具有綜合性和復(fù)雜性。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)酰基CoA合成酶[25]在老年大鼠肝臟組織中表達(dá)減少，可能與脂質(zhì)代謝異常調(diào)節(jié)相關(guān)。細(xì)胞衰老時(shí)，游離脂肪酸增多，對細(xì)胞損害增加，脂的降解能清除有害的游離脂肪酸，使這些降解的脂肪酸重新進(jìn)入到合成途徑中。我們研究發(fā)現(xiàn)附子、干姜、花椒可以上調(diào)?；鵆oA合成酶起到抗衰老的作用。這與文獻(xiàn)報(bào)道附子、干姜、花椒抗衰老機(jī)制一致[26-28]。

3.2.3 附子、干姜、花椒的鎮(zhèn)痛、抗炎作用 本文研究發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃給予附子、干姜、花椒水煎液后，與鎮(zhèn)痛、抗炎相關(guān)的羧酸酯酶1表達(dá)上調(diào)，兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下調(diào)。羧酸酯酶1[29](Carboxylesterase1，CES1)是膽固醇酯水解酶家族成員之一，主要功能是將膽固醇酯水解成為游離膽固醇并且排出巨噬細(xì)胞，使泡沫細(xì)胞的形成減少。最近研究表明[30-31]：CES1對系統(tǒng)和脂肪組織的炎性反應(yīng)有降低作用，使胰島素敏感性增強(qiáng)和糖耐量增加等作用。其中，CES1主要在肝臟中表達(dá)。大量研究表明：在感染和炎癥等病理狀態(tài)下，大多數(shù)藥物代謝酶在肝臟中的表達(dá)水平降低、活性下降，導(dǎo)致藥物清除率下降，進(jìn)而引起血漿藥物濃度增高發(fā)生藥物毒性反應(yīng)。兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-O-methyltransferase,COMT)主要功能是滅活含有兒茶酚結(jié)構(gòu)的神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)和機(jī)體組織內(nèi)分布，文獻(xiàn)研究表明[30-31]，COMT抑制劑目前在臨床上主要協(xié)助治療帕金森病、抗抑郁、抗Ⅱ型精神失常和治療神經(jīng)痛等疾病。已有文獻(xiàn)證明，附子、干姜、花椒都具有鎮(zhèn)痛[32-34]、抗炎[35-37]的作用，干姜的醚提物和水提物都具有顯著鎮(zhèn)痛抗炎作用。附子煎劑對急性炎癥模型有明顯抑制作用，同時(shí)對熱刺激所致小鼠疼痛有顯著抗炎鎮(zhèn)痛作用。實(shí)驗(yàn)證明，花椒和青椒的水提液都有明顯的鎮(zhèn)痛作用。臨床上用花椒乙醚提取物或花椒揮發(fā)油作為口腔科的安撫劑，進(jìn)行消炎止痛。結(jié)合藥理學(xué)研究的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果，認(rèn)為附子、干姜、花椒可能通過誘導(dǎo)羧酸酯酶1蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，通過下調(diào)兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。三者下調(diào)兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，能否成為該酶的抑制劑，需要我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

3.2.4 附子、干姜、花椒對心血管的作用 本文研究發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃給予附子、干姜、花椒水煎液后，與心血管相關(guān)的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、O-肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅱ表達(dá)上調(diào)，兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下調(diào)。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶[38](proteindisulfide isomerase,PDI)是氧化還原酶之一，主要功能包括促進(jìn)二硫鍵的形成與異構(gòu)化、促進(jìn)蛋白質(zhì)正常折疊與恢復(fù)未折疊和錯(cuò)誤折疊等，參與眾多蛋白的合成、成熟，在人體健康與復(fù)雜機(jī)制的疾病中發(fā)揮重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)：缺血性心臟病是導(dǎo)致死逐年增加，合并糖尿病患者死亡率明顯增加。PDI在心臟病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，PDI表達(dá)上調(diào)能降低心肌梗死面積，減少心肌細(xì)胞凋亡。O-肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅱ[39](CPTⅡ)缺乏會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)心律失常，臨床主要表現(xiàn)為心率慢、心音低鈍，心電圖表現(xiàn)為房室傳導(dǎo)阻滯，藥物治療無效。多巴胺(DA)主要參與人體精神活動和調(diào)控椎體外系的運(yùn)動功能。疾病的發(fā)生和發(fā)展都與多巴胺的增多和減少有關(guān)。但是DA代謝降解主要由兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)完成。COMT抑制劑可以減慢DA的代謝，且可以延長左旋多巴(L-dopa)在體內(nèi)的半衰期，達(dá)到治療由于DA減少的引起帕金森、抑郁等相關(guān)疾病[40]。附子、干姜、花椒在臨床上被廣泛應(yīng)該在心血管相關(guān)疾病中[41-43]，本實(shí)驗(yàn)篩選出的50個(gè)差異蛋白，其中蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶和O-肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅱ在心血管中發(fā)揮重要作用。

3.2.5 附子、干姜、花椒的保肝作用 目前，附子、干姜、花椒對消化系統(tǒng)的作用主要表現(xiàn)在抗消化道潰瘍、保肝利膽、治療腹瀉等。本文研究發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃給予附子、干姜、花椒水煎液后，與保肝相關(guān)的蛋白質(zhì)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶在肝臟中低表達(dá)、谷胱甘肽過氧化物酶在肝臟中高表達(dá)。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶[44]又稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶，是肝功能檢查中常用指標(biāo)之一，主要分布在肝臟、心臟和骨骼肌，當(dāng)肝細(xì)胞受到破壞損傷或壞死時(shí)，血液中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)增高。因此，該酶是反映肝細(xì)胞受損程度最靈敏的指標(biāo)。谷胱甘肽過氧化物酶[45](Glutathione peroxidase，GSH-Px)是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。肝臟是合成多種抗氧化酶的主要器官，機(jī)體氧應(yīng)激時(shí)存在損傷肝臟，而肝臟受損后，合成抗氧化酶減少，進(jìn)一步加重機(jī)體的氧化應(yīng)激。脂質(zhì)過氧化在眾多肝病的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，作為集體抗氧化預(yù)防重要部分的GSH-Px在肝臟中分布豐富，因此GSH-Px與各種肝病關(guān)系密切。文獻(xiàn)表明附子、干姜、花椒都具有保肝作用[46-48]，主要通過影響丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷胱甘肽過氧化物酶的表達(dá)達(dá)到保肝效果。

圖1 附子、干姜、花椒共有藥理作用與差異蛋白分析

3.3 附子、干姜、花椒對機(jī)體物質(zhì)代謝和能量代謝的影響 采用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進(jìn)行Pathway注釋，得到差異蛋白所參與的所有途徑，篩選出差異蛋白顯著參與的途徑。附子、干姜、花椒共有的50個(gè)共有差異蛋白，主要分布在與能量代謝相關(guān)的通路或途徑。進(jìn)一步分析表明，附子、干姜、花椒主要是通過增加體內(nèi)熱量生成和提高對能量的利用兩大方面影響機(jī)體的能量代謝。從能量供應(yīng)的角度看，糖、脂及蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)素可以互相代替，并互相制約。由于糖、脂、蛋白質(zhì)分解代有共同的通路，所以，任何一個(gè)供能物質(zhì)的分解代謝占優(yōu)勢，常能抑制和節(jié)約其他供能物質(zhì)的降解。體內(nèi)糖、脂、蛋白質(zhì)和核酸等的代謝不是彼此獨(dú)立，而是相互關(guān)聯(lián)，它們通過共同的中間代謝物，三羧酸循環(huán)和生物氧化等聯(lián)成整體。三者之間可以互相轉(zhuǎn)變，當(dāng)一種物質(zhì)代謝障礙時(shí)可引起其他物質(zhì)代謝的紊亂。詳見圖2。

本課題組在匡海學(xué)教授假說的支持下，早前已經(jīng)完成典型的寒性中藥(黃連、黃芩、黃柏)和熱性中藥(附子、干姜、花椒)代謝組學(xué)的研究，為寒熱藥性理論的研究創(chuàng)建了一個(gè)新的方法學(xué)平臺。2011年，匡海學(xué)等[49]采用UPLC-QTOF-MS法、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA)法等技術(shù)，確定18個(gè)與能量代謝相關(guān)的內(nèi)源性生物標(biāo)志物。其中天冬氨酸、L-2氨基乙二酸、5-磷酸核糖、木酮糖等與能量代謝相關(guān)的生物標(biāo)記物在附子、干姜、花椒中上調(diào)。天冬氨酸又稱天門冬氨酸，是一種α-氨基酸，天冬氨酸的L-異構(gòu)物是20種蛋白胺基酸之一，即蛋白質(zhì)的構(gòu)造單位[50]。它是生物體內(nèi)賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體。它可作為K+、Mg2+離子的載體向心肌輸送電解質(zhì)，從而改善心肌收縮功能，同時(shí)降低氧消耗，在冠狀動脈循環(huán)障礙缺氧時(shí)，對心肌有保護(hù)作，它參與鳥氨酸循環(huán)，促進(jìn)氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增強(qiáng)肝臟功能，消除疲勞，天冬氨酸主要參與氨基酸代謝影響機(jī)體的能量代謝；半乳糖是一種由六個(gè)碳和一個(gè)醛組成的單糖，歸類為醛糖和己糖。它常以D-半乳糖苷的形式存在于大腦和神經(jīng)組織中，也是某些糖蛋白的重要成分，是由乳類食物中的乳糖水解而來，其代謝主要是通過半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶及其所催化的酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟嵌焕?，主要參與半乳糖代謝影響機(jī)體的能量代謝；6-磷酸葡萄糖醛酸和5-磷酸核糖是磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物，5-磷酸核糖是嘌呤核苷酸合成的原料。磷酸戊糖途徑產(chǎn)生NADPH，作為供氫體，參與體內(nèi)多種生物合成反應(yīng)，包括脂肪酸、膽固醇和類固醇激素的生物合成[51]；木酮糖是一種戊酮糖。在生物體內(nèi)L型與D型的木酮糖先還原成木糖醇，繼之再氧化而相互轉(zhuǎn)換。D-木酮糖與ATP反應(yīng)生成D-木酮糖-5-磷酸而進(jìn)入磷酸戊糖途徑。因此成為另一糖酵解途徑的磷酸戊糖途徑的重要的中間物；白三烯具有共軛三烯結(jié)構(gòu)的二十碳不飽和酸，參與花生四烯酸代謝，白三烯在呼吸道的炎癥、誘導(dǎo)鼻過敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。這些代謝物主要參與氨基酸代謝、糖代謝、花生四烯酸代謝、磷酸戊糖途徑來影響機(jī)體的能量代謝。

本實(shí)驗(yàn)差異蛋白共有18個(gè)代謝通路與能量代謝相關(guān)，其中糖代謝、磷酸戊糖途徑、氨基酸代謝等途徑與匡海學(xué)教授研究的代謝組學(xué)影響能量代謝途徑相一致，將代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)附子、干姜、花椒無論是大分子還是小分子都主要參與糖代謝、脂肪酸代謝、磷酸戊糖途徑、氨基酸代謝等途徑增加機(jī)體內(nèi)熱量的生成，提高對能量的利用來影響機(jī)體的能量代謝。

3.3.1 附子、干姜、花椒增加機(jī)體內(nèi)熱量生成 本文通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，附子、干姜、花椒參與能量代謝的主要途徑如下。

丙酮酸代謝途徑[52]：丙酮酸是體內(nèi)產(chǎn)生的三碳酮酸，它是糖酵解途徑的最終產(chǎn)物，在細(xì)胞漿中還原成乳酸供能，或進(jìn)入線粒體內(nèi)氧化生成乙酰CoA，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，被氧化成二氧化碳和水，完成葡萄糖的有氧氧化供能過程。因此，丙酮酸在三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明：附子、干姜、花椒上調(diào)醛脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羥激酶有影響丙酮酸代謝途徑，進(jìn)而增加機(jī)體內(nèi)熱量的生成。

三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic Acid Cycle，TCA)途徑：TCA是主要的能量代謝途徑之一，大多數(shù)需氧生物體內(nèi)存在的代謝途徑，不僅是糖類、脂類、氨基酸的最終代謝通路，也是糖類、脂類、氨基酸代謝之間關(guān)聯(lián)的樞紐中心。三羧酸循環(huán)另一重要功能是為其他合成代謝提供小分子前體。附子、干姜、花椒可以上調(diào)磷酸烯醇式丙酮酸羥激酶，加快三羧酸循環(huán)，增加體內(nèi)熱量的生成。

淀粉-蔗糖代謝途徑：機(jī)體的各個(gè)方面都受到糖類的影響，其不僅能提供呼吸底物和中間代謝產(chǎn)物所需要的能量，還能適用于生命基礎(chǔ)物質(zhì)的合成和生命物質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分。糖原磷酸化酶[53](glycogen phosphoryl-ase)是催化糖原降(glycogen nolysis)的關(guān)鍵酶，該酶催化糖原的磷酸解，產(chǎn)生的葡萄糖-1-磷酸在磷酸葡萄糖變位酶催化下轉(zhuǎn)變成葡萄糖-6-磷酸，后者或是在葡萄精-6-磷酸酶催化下生成葡萄糖，為機(jī)體組織提供葡萄糖，或是直接進(jìn)入無氧代謝和有氧代謝途徑以參與能量供應(yīng)。附子、干姜、花椒可以上調(diào)糖原磷酸化酶、UDP-葡萄糖-6-脫氫酶影響淀粉-蔗糖代謝途徑，使體內(nèi)熱量生成增加。

糖酵解/糖異生途徑[55]：糖異生作用和糖酵解作用是互相關(guān)聯(lián)和制約。其中一條途徑活躍時(shí)，另一途徑的活性就相應(yīng)降低，磷酸果糖激酶(糖酵解)和果糖-1,6-二磷酸酶(糖異生)是調(diào)控作用的關(guān)鍵酶。當(dāng)葡萄糖供應(yīng)相對比較充足時(shí)，果糖-2,6-二磷酸作為細(xì)胞內(nèi)的分子信號也處于相對高水平。它能活化糖酵解作用并抑制糖異生途徑。果糖-2,6-二磷酸受到破壞則引起果糖-1,6-二磷酸酶活性加強(qiáng)，從而加速糖異生作用。附子、干姜、花椒上調(diào)醛脫氫酶X、磷酸烯醇式丙酮酸羥激酶影響糖酵解/糖異生途徑，進(jìn)而影響能量代謝。

脂肪酸代謝途徑[56]：脂肪酸是機(jī)體主要能量來源之一。脂肪酸在有氧的情況下，可以氧化分解為CO2和H2O，釋放大量能量，脂肪酸氧化最活躍的組織是肝臟和肌肉，其最主要的氧化形式是β-氧化。脂肪酸β-氧化過程中生成的乙酰CoA，乙酰CoA作為重要的中間化合物，不僅能進(jìn)入三羧酸循環(huán)氧化供能，還是許多重要化合物(酮體、膽固醇和類固醇)合成的原料。附子、干姜、花椒上調(diào)O-肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2、醛脫氫酶X影響脂肪酸代謝途徑，增加熱量生成。

類固醇激素生物合成途徑[57]：甾體激素具有極重要的醫(yī)藥價(jià)值，在維持生命、調(diào)節(jié)性功能，對機(jī)體發(fā)展、免疫調(diào)節(jié)、皮膚疾病治療及生育控制方面有明確的作用。許多類固醇激素都有良好的調(diào)節(jié)糖代謝和水鹽代謝的功能。附子、干姜、花椒上調(diào)類固醇17-α-羥化酶、CYP4503A18、角鯊烯單加氧酶的表達(dá)，調(diào)控參與類固醇激素的合成，可促進(jìn)激素轉(zhuǎn)化，減少其滅活和排泄。

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)途徑[66-68]：為核受體超家族之一，主要包括PPARα、PPARβ和PPARγ三種亞型，主要參與調(diào)節(jié)糖代謝平衡、脂質(zhì)和脂蛋白代謝、細(xì)胞增殖與分化和凋亡。近年來該信號通路的表達(dá)及干預(yù)的意義已開始成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，酰基輔酶A合成酶(ACS)主要分布于肝臟和腎臟，可促進(jìn)肝臟攝取脂蛋白脂酶脂解生成的游離脂肪酸，并轉(zhuǎn)化為乙酰CoA，防止脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞后的流失。我們研究發(fā)現(xiàn)附子、干姜、花椒可以上調(diào)膽酰CoA合成酶，增加乙酰CoA的生成，進(jìn)入三羧酸循環(huán)氧化供能，熱量生成增多。

花生四烯酸代謝[63](Arachidonic acid metabolism)途徑：包括環(huán)氧化酶(COX)、脂氧合酶(LOX)和細(xì)胞色素P450(CYP450)3種途徑，花生四烯酸系統(tǒng)對細(xì)胞和器官功能的影響主要依賴幾十種相關(guān)酶的共同作用，上百種代謝產(chǎn)物與相應(yīng)的蛋白質(zhì)(包括受體、信號分子等)結(jié)合和相互作用等共同介導(dǎo)。細(xì)胞功能狀態(tài)改變或受到外界刺激能導(dǎo)致花生四烯酸代謝通路的改變，同時(shí)也影響每個(gè)通路代謝產(chǎn)物之間的穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)胞乃至機(jī)體的功能紊亂。特別是花生四烯酸代謝一條通路改變或出現(xiàn)異常時(shí)，會直接或間接影響其他代謝途徑、甚至?xí)绊懮矬w的整體代謝。細(xì)胞色素P450(cytochromeP450或CYP450)[64]是一種含亞鐵血紅素的單加氧酶，主要分布于肝臟，在小腸、肺、腎、腦中也依次有少量分布。哺乳動物組織中P450在藥物和異型生物的代謝。它參與內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)代謝。細(xì)胞色素P450作為一種末端加氧酶，主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上，參與生物體內(nèi)類固醇激素合成、膽汁酸、膽固醇及多未飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為生物活性分子的過程中都起著重要作用[65]。由于細(xì)胞色素P450也對細(xì)胞因子和體溫調(diào)節(jié)都有重要影響，附子、干姜、花椒可以上調(diào)細(xì)胞色素P450 3A18，調(diào)控參與類固醇激素的合成，可促進(jìn)激素轉(zhuǎn)化，減少其滅活和排泄，提示附子、干姜、花椒促進(jìn)生物體內(nèi)類固醇代謝，增強(qiáng)機(jī)體代謝過程。

3.3.2 附子、干姜、花椒提高對能量的利用 附子、干姜、花椒提高對能量的利用主要通過如下途徑。

氨基酸代謝途徑[58]：氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單位，也能作為嘧啶、嘌呤、卟啉等生物合成的前體。其主要功能是合成蛋白質(zhì)，也合成多肽及其他含氮的生理活性物質(zhì)，體內(nèi)的各種含氮物質(zhì)幾種都可由氨基酸轉(zhuǎn)變而成，包括蛋白質(zhì)、膚類激素、氨基酸衍生物、黑色素、肌酸、胺類、輔酶或輔基等，并可以氧化分解代謝提供機(jī)體所需能量；氨基酸分解所生成的α-酮酸可以轉(zhuǎn)變成糖、脂類或再合成某些非必需氨基酸，也可以經(jīng)過三羧酸循環(huán)氧化成二氧化碳和水，并放出能量。本次研究發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃給予附子、干姜、花椒水煎液后，與氨基酸代謝相關(guān)的蛋白醛氧化酶X、D-氨基酸氧化酶上調(diào)，醛氧化酶(Aldehyde Oxidase，AOX)是一類高度保守的鉬-黃素蛋白，主要存在于哺乳動物細(xì)胞質(zhì)中，具有廣泛的底物特異性，可催化醛類及含氮、含氧雜環(huán)類化合物的氧化反應(yīng)。該酶體內(nèi)分布較廣，存在種屬及個(gè)體間差異，在藥物及外源物的I相代謝中發(fā)揮重要作用。AOX依賴的代謝反應(yīng)可能影響相關(guān)藥物的藥效、代謝特性與毒性反應(yīng)。D-氨基酸氧化酶(D-amino Acid Oxidase：Oxidoreductase，DAAO)[59]是一種典型黃素蛋白酶，以黃素腺嘌呤為輔基?？裳趸疍-氨基酸的氨基生成相應(yīng)的酮酸和氨，使生糖、生酮氨基酸分解加快，提高對能量的利用。

N-聚糖生物合成途徑：N-聚糖主要參與新生膚鏈的折疊、維持蛋白質(zhì)正確構(gòu)象的生理過程，極性細(xì)胞中蛋白質(zhì)的分揀。N-聚糖生物合成需要消耗能量，本實(shí)驗(yàn)上調(diào)N-聚糖生物合成途徑中的多萜基二磷酸寡聚糖蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶1，提高對能量的利用。

核糖體(Ribosome)[54]，又稱核蛋白體，細(xì)胞中普遍存在核糖體除哺乳動物成熟的紅細(xì)胞。核糖體是細(xì)胞內(nèi)一種核糖核蛋白顆粒(ribonucleoprotein particle)，主要由RNA(rRNA)和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其惟一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質(zhì)多肽鏈，所以核糖體是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的分子機(jī)器。附子、干姜、花椒上調(diào)60S酸性核糖體磷蛋白P2，蛋白質(zhì)合成旺盛，耗能增多。

脂肪酸生物合成途徑[60]：脂肪酸生物合成是機(jī)體代謝途徑之一，具有廣泛的應(yīng)用前景，肝臟是脂肪酸生物合成的主要部位，同時(shí)也在腦、肺、腎等組織中合成。脂肪酸合成的起始原料是乙酰輔酶A，在細(xì)胞液中進(jìn)行。機(jī)體內(nèi)的脂肪酸大部分來源于食物，為外源性脂肪酸，在體內(nèi)可通過改造加工被機(jī)體利用。同時(shí)機(jī)體還可以利用糖和蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅岱Q為內(nèi)源性脂肪酸，用于甘油三酯的生成，貯存能量。脂肪酸合酶[61](Fatty Acid Synthase，F(xiàn)ASN)是多功能酶復(fù)合體，主要參與內(nèi)源性長鏈脂肪酸的合成，是體內(nèi)合成內(nèi)源性飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶，在體內(nèi)各組織中廣泛存在，參與細(xì)胞增殖、分化和機(jī)體能量代謝、脂類代謝等重要生命活動。有研究表明[69]：抑制FASN，可使乙酰CoA更多進(jìn)入三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量而被消耗，從而減少脂肪的合成和儲存。Kim等研究表明，F(xiàn)ASN的抑制劑C75可以通過激活CPT-1酶使得小鼠周圍脂肪組織的β氧化活躍，增加機(jī)體的脂肪消耗。附子、干姜、花椒可以抑制脂肪酸合酶，提高對機(jī)體能量的利用。

胰島素信號通路[62]：肝臟在人體的葡萄糖代謝中有著重要作用，從胰島素與其受體(InsR)結(jié)合開始，肝臟糖代謝構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的傳導(dǎo)通路，起到穩(wěn)定血糖的生理作用。肝臟胰島素抵抗主要表現(xiàn)為胰島素抑制內(nèi)源性葡萄糖生成的能力減弱和肝糖原合成減少。肝臟是人體內(nèi)葡萄糖攝取和利用的重要場所。葡萄糖進(jìn)入肝細(xì)胞后，一部分進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量，另一部分在糖原合成酶的作用下合成肝糖元。糖原磷酸化酶[53](glycogen phosphoryl-ase)是催化糖原降解的關(guān)鍵酶，為機(jī)體組織提供葡萄糖，或是直接進(jìn)入無氧代謝和有氧代謝途徑以參與能量供應(yīng)。糖原合酶是糖原合成過程的限速酶，糖原合成是耗能過程。本次研究發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃給予附子、干姜、花椒水煎液后，與胰島素信號通路相關(guān)的蛋白糖原合酶上調(diào)，糖原合成增多，耗能增多，但是同時(shí)能上調(diào)糖原磷酸化，加快肝糖原分解，供應(yīng)機(jī)體所需能量。

機(jī)體內(nèi)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的氧化分解提供人體一切生命活動所需要的全部能量，糖、脂肪和蛋白質(zhì)這三類營養(yǎng)物質(zhì)中包含能被機(jī)體利用的化學(xué)能，是人體活動的直接能源物質(zhì)。能量代謝與物質(zhì)代謝相互影響，物質(zhì)在合成代謝時(shí)，需要獲取能量，而物質(zhì)在氧化分解過程中，伴有能量的釋放。通常我們把伴隨物質(zhì)代謝過程中發(fā)生的能量的貯存、釋放、轉(zhuǎn)移和利用稱為能量代謝。熱性中藥附子、干姜、花椒主要通過調(diào)控代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)來影響機(jī)體代謝過程，增加體內(nèi)熱量的產(chǎn)生和提高對熱量的利用兩方面影響機(jī)體的能量代謝。其中主要通過調(diào)控脂肪酸代謝、類固醇激素生物合成、谷胱甘肽代謝、細(xì)胞色素P450代謝、糖代謝、檸檬酸循環(huán)等十幾個(gè)代謝途徑增加機(jī)體熱量的生成，通過控制和調(diào)節(jié)氨基酸代謝、N-聚糖生物合成、核糖體、脂肪酸生物合成、胰島素信號通路5個(gè)代謝途徑提高機(jī)體對能量的利用。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明附子、干姜、花椒是通過不同途徑影響機(jī)體的能量代謝，促進(jìn)機(jī)體能量代謝的中藥具有熱(或溫)性，與匡海學(xué)教授的中藥性味科學(xué)內(nèi)涵新假說相一致。

圖2 熱性中藥的共有差異蛋白通路分析

4 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)是指在特定的時(shí)間和空間內(nèi)一個(gè)基因組、一種組織或一種生物、細(xì)胞所表達(dá)的包括所有亞型以及經(jīng)過修飾的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的表達(dá)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的功能分別稱為表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)，是蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究內(nèi)容?，F(xiàn)階段，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注，因?yàn)槿梭w的各種代謝和調(diào)控途徑主要由蛋白質(zhì)執(zhí)行，我們只有不斷進(jìn)行篩選和鑒定樣本中的蛋白，才能進(jìn)一步探明疾病的發(fā)生、監(jiān)控疾病的進(jìn)程和每個(gè)階段相應(yīng)的蛋白表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性及規(guī)律性。為尋找藥物的作用靶點(diǎn)、作用模式、藥物的功效，毒理研究和篩選疾病的標(biāo)志性蛋白奠定理論基礎(chǔ)。使我們對人類生命本質(zhì)的認(rèn)識和疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提升到一個(gè)更高的層次。

本實(shí)驗(yàn)選擇iTRAQ技術(shù)，該技術(shù)是在2004年由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司推出的一項(xiàng)新的同位素標(biāo)記技術(shù)。基本工作原理為：iTRAQ標(biāo)記試劑能與賴氨酸側(cè)鏈或肽段的N端發(fā)生反應(yīng)，完成對肽段的標(biāo)記。標(biāo)記完成后對本次實(shí)驗(yàn)所有樣本進(jìn)行混合，一次可同時(shí)處理的樣本數(shù)為8個(gè)。首先進(jìn)行一級質(zhì)譜，在選擇母離子時(shí)，不同標(biāo)記的樣本同一個(gè)肽段表現(xiàn)為一個(gè)峰，和一級質(zhì)譜強(qiáng)度相比較增強(qiáng)了8倍，有利于廣泛的鑒定。然后進(jìn)行二級質(zhì)譜，iTRAQ試劑發(fā)生斷裂，其中平衡基團(tuán)發(fā)生中性丟失，該基團(tuán)主要使iTRAQ試劑整體質(zhì)量一樣。報(bào)告基團(tuán)的強(qiáng)度直接反映肽段的相對豐度，其質(zhì)量從113-121，但是不包括120，因?yàn)?20和苯丙氨酸的亞胺離子相同。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，相對于傳統(tǒng)的定性及定量方法，該技術(shù)對蛋白的檢測范圍廣泛，pH值檢測線性范圍為0-13；對蛋白的分子量檢測范圍更廣泛，可以檢測蛋白的分子量為8-280KD的蛋白；iTRAQ技術(shù)可以檢測出更多的低豐度(蛋白含量)蛋白，甚至對其他技術(shù)不能檢測到的跨膜蛋白也可以靈敏的檢測到。因具有高靈敏度、標(biāo)記效率高、高分辨率、樣品兼容性好、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，使該技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究和應(yīng)用中被廣泛應(yīng)用。

匡海學(xué)教授提出的中藥性(氣)味科學(xué)內(nèi)涵的新假說，其核心內(nèi)容之一是“中藥的藥性(氣)是藥物通過不同途徑以主要影響機(jī)體的能量代謝、物質(zhì)代謝為特征的，可影響藥物療效發(fā)揮或與副作用發(fā)生有關(guān)的一類生物學(xué)效應(yīng)。促進(jìn)機(jī)體能量代謝、物質(zhì)代謝的中藥具有熱(或溫)性，抑制機(jī)體能量代謝、物質(zhì)代謝的中藥具有寒(或涼)性?！睋?jù)此可以認(rèn)為，能夠系統(tǒng)反映機(jī)體代謝狀況的代謝組學(xué)技術(shù)與方法以及能夠系統(tǒng)反映調(diào)控機(jī)體代謝狀況的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與方法，是非常適于中藥藥性研究的技術(shù)與方法。

本文依據(jù)匡海學(xué)教授的中藥性味科學(xué)內(nèi)涵新假說，基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的研究方法，通過對代表性的溫?zé)嶂兴幐阶?、干姜和花椒開展大鼠能量代謝和生物標(biāo)志物相結(jié)合的研究，探討溫?zé)嶂兴幵谟绊憴C(jī)體物質(zhì)代謝和能量代謝以及三者在藥味和功效中存在的共性。

眾所周知，附子、干姜、花椒均為溫?zé)嶂兴帲⒕哂邢嗨频乃幬逗凸π?，現(xiàn)代研究也證明三者在藥理作用上存在共性，為加強(qiáng)治療效果，有時(shí)臨床還配伍使用。

本文研究結(jié)果表明：附子、干姜、花椒篩選出共同差異蛋白(誘導(dǎo)或抑制相關(guān)蛋白)，在抗腫瘤、抗衰老、保肝、鎮(zhèn)痛、抗炎、對心血管的作用中能對抗相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展，這可能是三者具有相似藥味和功效的真正內(nèi)涵，也為揭示中醫(yī)臨床“同病異治”，臨床應(yīng)用中藥配伍的復(fù)方提供理論依據(jù)。

研究結(jié)果還證明，溫?zé)嶂兴幐阶?、干姜和花椒的確都能通過多途徑增強(qiáng)機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量代謝。同時(shí)，篩選出溫?zé)嶂兴幐阶?、干姜和花椒與機(jī)體物質(zhì)代謝和能量代謝相關(guān)的50個(gè)差異蛋白。在此基礎(chǔ)上，通過DAVID蛋白通路分析，篩選出與能量代謝相關(guān)通路18個(gè)。通過本文蛋白質(zhì)組學(xué)的研究闡明，熱性中藥附子、干姜、花椒影響機(jī)體物質(zhì)代謝和能量代謝主要通過兩條途徑來實(shí)現(xiàn)的。一是主要通過調(diào)控代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，如通過上調(diào)糖原磷酸化酶、UDP-葡萄糖6-脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羥激酶等相關(guān)蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)丙酮酸代謝途徑、三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝、糖代謝(淀粉-蔗糖代謝、核糖體、糖酵解/糖異生)等途徑的相關(guān)蛋白質(zhì)來影響機(jī)體代謝過程，加快肝糖原分解，減少糖原合成，增加體內(nèi)熱量的產(chǎn)生；并通過上調(diào)O-肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2、醛脫氫酶X蛋白的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸代謝，增加體內(nèi)熱量的產(chǎn)生；通過過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)途徑上調(diào)膽酰CoA合成酶，增加乙酰CoA的生成，進(jìn)入三羧酸循環(huán)氧化供能，熱量生成增多；通過花生四烯酸代謝(Arachidonic Acid Metabolism)途徑，上調(diào)細(xì)胞色素p450 3A18，調(diào)控參與類固醇激素的合成，可促進(jìn)激素轉(zhuǎn)化，減少其滅活和排泄，增強(qiáng)機(jī)體代謝過程。二是熱性中藥附子、干姜、花椒通過調(diào)控氨基酸代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，如通過氨基酸代謝途徑，上調(diào)蛋白醛氧化酶X、D-氨基酸氧化酶，增強(qiáng)體內(nèi)氨基酸代謝、生酮或生糖氨基酸的分解代謝，產(chǎn)生三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物或轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蚶^續(xù)氧化提供能量；通過上調(diào)類固醇17-α-羥化酶的表達(dá)，調(diào)控參與類固醇激素的合成，促進(jìn)生物體內(nèi)類固醇代謝，并能通過N-聚糖生物合成途徑，上調(diào)N-聚糖生物合成途徑中的多萜基二磷酸寡聚糖蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶1，提高對能量的利用；通過脂肪酸生物合成途徑，下調(diào)脂肪酸合酶的表達(dá)，提高對機(jī)體能量的利用；通過胰島素信號通路上調(diào)相關(guān)的蛋白糖原合酶，使糖原合成增多，耗能增多。

這些研究結(jié)果，與此前匡海學(xué)等[38]采用UPLC-QTOF-MS法確定18個(gè)與能量代謝相關(guān)的內(nèi)源性生物標(biāo)志物，而這些代謝物主要參與氨基酸代謝、糖代謝、花生四烯酸代謝、磷酸戊糖途徑來影響機(jī)體的能量代謝結(jié)果相一致。這也進(jìn)一步驗(yàn)證了匡海學(xué)教授提出的中藥性味科學(xué)內(nèi)涵新假說的客觀性。

綜上所述，中藥藥性具有整體性、動態(tài)性、時(shí)空性、復(fù)雜性等特點(diǎn)，這與蛋白質(zhì)組和代謝組學(xué)的很多特征相似，所以以蛋白質(zhì)組學(xué)為切入點(diǎn)進(jìn)行中藥藥性實(shí)質(zhì)研究具有很大的優(yōu)勢，目前的研究成果也表明，這一研究思路是可行的，突破了中藥藥性理論研究的局限性，成為理論研究與實(shí)驗(yàn)研究的橋梁。因此將蛋白質(zhì)組和代謝組結(jié)合為切入點(diǎn)，深入進(jìn)行中藥藥性實(shí)質(zhì)的研究，不僅有利于從微觀的角度了解中藥藥性的物質(zhì)基礎(chǔ)，而且將為中藥藥效的研究提供理論依據(jù)，也將為中藥藥性研究提供新的思路和方法，這些對促進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化將具有重要作用。組學(xué)概念的提出為作者提供一個(gè)整體研究中藥藥性的新思路。通過高通量、大規(guī)模的整體研究模式，從系統(tǒng)生物學(xué)(蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué))系統(tǒng)地研究中藥藥性理論，可以全面了解相關(guān)基因、蛋白質(zhì)或代謝物在機(jī)體發(fā)生、發(fā)展過程中的變化規(guī)律。目前，對于中藥藥性的研究，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究的相比較多。建立和完善蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)平臺，可從兩個(gè)水平(蛋白組學(xué)、代謝組學(xué))檢測目的樣品的差異性，篩選出組織、細(xì)胞、機(jī)體的病理生理或代謝水平的潛在變化。代謝組(metabolomics)學(xué)來源于代謝譜分析。代謝組學(xué)不僅能全面定量的闡釋內(nèi)源性代謝物，還對內(nèi)因和外因變化規(guī)律有一定的影響，代謝組學(xué)方面是篩選代謝循環(huán)中相對分子質(zhì)量小于1000的小分子內(nèi)源性代謝物的變化，檢測的內(nèi)源性代謝物直接參與機(jī)體的各種代謝、循環(huán)，其水平高低在一定程度上反映了機(jī)體生化代謝的功能和狀態(tài)或細(xì)胞、組織的代謝應(yīng)答變化。蛋白質(zhì)組學(xué)主要采用雙向凝膠電泳(2DE)、雙向熒光差異凝膠電泳(DIGE)、質(zhì)譜(MS)及蛋白芯片等方法對蛋白的表達(dá)、分布、相互作用等進(jìn)行全面的、整體的研究，即研究組織或細(xì)胞中全部蛋白質(zhì)的科學(xué)。主要采用分子生物學(xué)先進(jìn)的篩選技術(shù)，對組織或細(xì)胞中蛋白質(zhì)的整體進(jìn)行歸類、鑒定并分析感興趣的差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，最終明確它們的功能、相互作用。中藥藥性在蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)方面的任務(wù)不僅是鑒定出差異蛋白質(zhì)和差異代謝產(chǎn)物，關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)，要進(jìn)一步明確蛋白質(zhì)功能和全面了解蛋白質(zhì)及它們的修飾和相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，關(guān)于代謝組學(xué)，是要去分析影響中藥藥性的代謝途徑，并將代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)聯(lián)起來，整合成垂直型分析，這樣能夠較完整地揭示藥物如何通過多種途徑作用于生物體多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮整合調(diào)節(jié)的優(yōu)越性及其機(jī)理，同時(shí)對療效評估也具有重要意義。這種“整合”的研究方式也正是系統(tǒng)生物學(xué)的重點(diǎn)。希望在代謝組學(xué)的協(xié)助下，中藥藥性在蛋白質(zhì)組學(xué)上能夠?qū)⒒A(chǔ)研究成果快速轉(zhuǎn)化成實(shí)用方法，應(yīng)用到更多領(lǐng)域中。

本文借助蛋白組學(xué)研究思路與技術(shù)，針對復(fù)雜生物樣本的特殊性，開發(fā)了全新的目標(biāo)蛋白富集、目標(biāo)蛋白定性定量—iTRAQ技術(shù)。建立的這種基于iTRAQ技術(shù)結(jié)合2D-LC-MS/MS評價(jià)溫?zé)嶂兴?附子、干姜、花椒)對機(jī)體肝臟組織的能量代謝及物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白定量的方法，也可作為評價(jià)中藥寒熱藥性的普適性方法。

實(shí)際上，寒熱藥性是從藥物對機(jī)體陰陽盛衰、寒熱變化的影響這一特定角度概括藥物的作用的，并不能包括藥物的所有功效。本次獲得的蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)與信息，不僅包含了藥物寒熱藥性的信息，肯定也包含著藥物藥味(功效或藥效)的信息，亦或有些信息既是藥物寒熱藥性的信息，同時(shí)也是藥物藥味(功效或藥效)的信息。這也證實(shí)了匡海學(xué)教授的中藥性味科學(xué)內(nèi)涵新假說中關(guān)于“中藥同時(shí)具有性(氣)與味，性(氣)與味是中藥(包括方劑、單味中藥、有效部位或組分、單體化合物)同時(shí)兼具的兩種特性。藥味與藥物的具體功效相關(guān)?！钡恼_性。另一方面，在這些信息中，不僅能夠找出溫?zé)嶂兴幍墓灿猩飿?biāo)志物信息，如同本文所述的那樣，也能找到或發(fā)現(xiàn)不同溫?zé)嶂兴幍奶赜械纳飿?biāo)志物的信息。因此，對獲得的這些蛋白質(zhì)組學(xué)信息的深入發(fā)掘，進(jìn)一步對中藥的四性與五味，甚至與歸經(jīng)等開展綜合研究，全面認(rèn)識和掌握中藥的性能將成為我們后續(xù)的一項(xiàng)重要研究工作。

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(2015-12-09收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Based on proteomics to study the property and flavor of Radix Aconiti Lateralis Preparata，Rhizoma Zingiberis，Pricklyash Peel

Wang Qiuhong，Yang Xin，Li Xuelei，Yang Bingyou，Wang Yanhong，Kuang Haixue

(HeilongjianguniversityofChinesemedicine，KeyLaboratoryofChineseMedica，MinistryofEducation，HeilongjiangKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicinePharmacodynamicMaterial，Harbin150040,China)

Objective:Study on warm-heat natural herbs(adix Aconiti Lateralis Preparata，Rhizoma Zingiberis，Pricklyash Peel)energy metabolism and expression of liver protein in normal rats，and made warm-hot drug in property and flavor-effect-pharmacological effects difference sand similarities，to provide theoretical basis for the property and flavor of medicines scientific connotation of warm-heat natural herbs.Methods:Adopt Sprague Dawley rats，each group after continuous administration of 21 d，the rats were anesthetized via an intraperitoneal injection of 1% pentobarbital sodium(0.15 mL per 100 g body weight).Liver proteins are separated by differential centrifugation，BCA protein quantitation by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)，using iTRAQ technology combined with the 2D-LC-MS/MS analysis method identification of liver proteins.Results:Compared with the control group，warm-heat natural herbs have identified significantly altered 50 differential proteins，with 39 proteins significantly increased and 11 decreased in response.50 different proteins mainly distributed in 18 pathways，many pathways related to energy metabolism.Conclusion:Radix Aconiti Lateralis Preparata，Rhizoma Zingiberis and Pricklyash Peel such as warm-heat natural herbs have differences and similarities in proteomics.This commonality is reflected not only in the substance and energy metabolism，but also reflected in the pharmacological effects.Two aspects affect the body's energy metabolism：increasing heat generation and increase the energy utilization.The results of the study for “Chinese medicine has the property(gas)and flavor，the characteristics of characteristics of property(gas)and flavor.Flavor of a drug was related with specific efficacy.Property of a drug affects the body's energy metabolism and substance metabolism by different pass ways.Influencing therapeutic effects of drugs or lead to side-effect associated with biological effects.” Nature and flavor of medicines theory provides a scientific basis.At the same time as the evaluation of traditional Chinese medicine provides a new method for Cold and Hot natural properties.

Radix Aconiti Lateralis Preparata; Rhizoma Zingiberis; Pricklyash Peel; Nature and flavor of medicines; Cold and Hot natural properties; Energy metabolism; Pharmacological effect; Proteomics

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)資助項(xiàng)目(編號:2013CB531801)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(編號:2015009)

王秋紅(1969—)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制學(xué)及中藥藥性理論研究；Tel：(0451)87266856,E-mail：qhwang668@sina.com

匡海學(xué)(1955—)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥藥性理論及中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究；Tel:：(0451)82193001,E-mail：hxkuang56@163.com

R28

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.12.003